李好問+華鑫 龍億濤

摘要單細(xì)胞中化學(xué)成分的分析對(duì)細(xì)胞生長、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡等生理過程意義重大。飛行時(shí)間二次離子質(zhì)譜（SIMS）是一種高靈敏的表面質(zhì)譜成像技術(shù)，具有較高的空間分辨率，已被用于細(xì)胞及微區(qū)域分析。然而，生物有機(jī)分子較低的離子化效率限制了oSIMS在單細(xì)胞分析中的廣泛應(yīng)用。本研究采用金屬/基質(zhì)增強(qiáng)方法，明顯提高了脂質(zhì)的離子化產(chǎn)率。鍍金硅片上磷脂酰膽堿PC （0：0）標(biāo)樣在加入基質(zhì)后，準(zhǔn)分子離子峰強(qiáng)度增大為硅片上的65倍。相應(yīng)基底上單細(xì)胞表面脂質(zhì)信號(hào)同時(shí)增強(qiáng)，但由于細(xì)胞的不規(guī)則形貌以及復(fù)雜化學(xué)環(huán)境影響，脂質(zhì)信號(hào)增強(qiáng)幅度較小。在此基礎(chǔ)上，使用延時(shí)提?。―elayed extraction， DE）模式克服了細(xì)胞形貌帶來的影響，進(jìn)一步增強(qiáng)脂質(zhì)信號(hào)，并獲得了高質(zhì)量的單細(xì)胞脂質(zhì)成像圖。此方法為研究細(xì)胞代謝及細(xì)胞環(huán)境相互作用提供了新的途徑。

關(guān)鍵詞單細(xì)胞分析； 脂質(zhì)； 飛行時(shí)間二次離子質(zhì)譜； 金屬/基質(zhì)增強(qiáng)； 質(zhì)譜成像

1引 言

單個(gè)細(xì)胞在結(jié)構(gòu)、組成及代謝等方面存在差異，這種差異帶來的影響在組織、器官等的功能上均有所體現(xiàn)。針對(duì)多個(gè)細(xì)胞的常規(guī)分析方法測得的結(jié)果通常無法保留這些個(gè)體差異信息，難以準(zhǔn)確評(píng)估及預(yù)測細(xì)胞的生理學(xué)行為，因此，單細(xì)胞分析引起越來越多的關(guān)注[1]。單細(xì)胞分析的一個(gè)重要內(nèi)容是單細(xì)胞脂質(zhì)分析。脂質(zhì)代謝是細(xì)胞代謝的一部分，在外界環(huán)境刺激下，細(xì)胞代謝途徑將發(fā)生改變，同時(shí)誘導(dǎo)脂質(zhì)組分發(fā)生改變，例如丙肝病毒侵染細(xì)胞后，改變了膽固醇代謝，使得細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝物鏈甾醇增多[2， 3]； 人體乳腺組織為了應(yīng)對(duì)微環(huán)境的改變，其脂肪酸、磷脂酰肌醇等組成成分增加[]； 用谷物喂養(yǎng)的小鼠其腦部組織中膽固醇含量大大下降[5]。由此可見，脂質(zhì)與細(xì)胞代謝過程密切相關(guān)，單細(xì)胞脂質(zhì)分析對(duì)于理解細(xì)胞代謝過程具有重要意義。

單個(gè)細(xì)胞具有較小的尺寸（微米級(jí)）和極低的分析物量，這就要求單細(xì)胞分析手段具有極高的靈敏度及空間分辨率，因此，單細(xì)胞分析是一個(gè)大的挑戰(zhàn)[6]。單細(xì)胞成像是單細(xì)胞分析最重要的領(lǐng)域之一，目前用于單細(xì)胞成像的技術(shù)主要包括光學(xué)顯微鏡[7，8] 、電子顯微鏡[9]、掃描探針顯微鏡[10]及質(zhì)譜成像[11，12]等，這些技術(shù)為單細(xì)胞分析提供了豐富的結(jié)構(gòu)、形貌及組分空間分布等信息[13，1]。質(zhì)譜成像是一種非標(biāo)記的化學(xué)成像方法，可以同時(shí)對(duì)多種成分進(jìn)行成像分析[15，16]。目前的質(zhì)譜成像技術(shù)主要包括基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜（MALDIoMS）[17]、解吸附電噴霧質(zhì)譜（DESIMS）[18]及二次離子質(zhì)譜（SIMS）[19]。MALDIoMS常用于組織成像，然而其空間分辨率仍難以滿足單細(xì)胞分析的需求，目前報(bào)道的最高橫向分辨率為5 μm[20]。SIMS在質(zhì)譜成像中具有最高的空間分辨率，其橫向分辨率可達(dá)100 nm以下，適用于單細(xì)胞成像。飛行時(shí)間二次離子質(zhì)譜（oSIMS）使用飛行時(shí)間檢測器，具有較高質(zhì)量分辨率。目前oSIMS用于單細(xì)胞分析已有報(bào)道[21～23]，但其對(duì)于生物分子較低的離子化產(chǎn)率一直是限制其應(yīng)用的主要問題之一。為了提高二次離子化產(chǎn)率，主要從新型離子源[2]、激光輔助置后電離[25]以及基質(zhì)增強(qiáng)[26]等方面展開研究。本研究利用MALDIoMS中常用的基質(zhì)材料2，5二羥基苯甲酸（DB）和貴金屬基底增強(qiáng)脂質(zhì)分子在oSIMS檢測中的離子化產(chǎn)率，并進(jìn)一步優(yōu)化儀器參數(shù)，以期獲得高質(zhì)量的單細(xì)胞成像結(jié)果。

2實(shí)驗(yàn)部分

21儀器與試劑

Denton電子束蒸發(fā)設(shè)備（美國Denton公司）； Petroff細(xì)胞計(jì)數(shù)器（美國ausser公司）； 冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)公司）； 飛行時(shí)間二次離子質(zhì)譜（oSIMS，德國IONO公司）。

醋酸銨、丙酮、乙醇、2O2及2SO（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑公司）； 磷脂酰膽堿（PC （0：0）， 美國Avanti Polar Lipids公司）； 人乳腺癌MC7細(xì)胞（南京凱基生物公司）； 2，5二羥基苯甲酸（DB）、10% 胎牛血清（SigmaAldrich公司）； 其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水由MilliQ超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）制備。硅片（1 cm×1 cm， 北京中鏡科儀有限公司）。

22實(shí)驗(yàn)方法

221樣品前處理硅片依次在丙酮、乙醇和水中超聲30 min，用去離子水吹洗后，氮?dú)獯蹈桑缓笥秒娮邮舭l(fā)儀先鍍3 nm鈦，再鍍30 nm金。洗干凈的硅片及鍍金膜的硅片在Piranha洗液（2SO2O2，3∶1， V/V）中清洗30 s除去表面有機(jī)物，再用去離子水沖洗，氮?dú)獯蹈?。磷脂PC （0∶0）加正癸烷溶解， 配制成2 mmol/L的溶液，并用水稀釋至50 μmol/L。

222細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌MC7細(xì)胞接種于Piranha洗液清洗后的硅片或金片，并使用RPMI160培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入10% 胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL 鏈霉素，將細(xì)胞置于37 ℃，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)2 h。細(xì)胞密度由細(xì)胞計(jì)數(shù)器測得。

23樣品制備

培養(yǎng)結(jié)束后將基片取出，置于150 mmol/L 醋酸銨溶液（p 7）中清洗30 s，以去除細(xì)胞表面殘留的鹽，使用Kimwipe無塵紙將金片邊緣的水吸干，在細(xì)胞上方滴加10 μL 01 mg/mL DB溶液，立即轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行快速冷凍，然后冷凍干燥。

分別在硅片和鍍金硅片上滴加2 μL上述磷脂PC（0：0）溶液，然后在其中一片鍍金硅片的磷脂溶液中加入05 μL 001 mg/mL DB溶液，待基片上溶液變干。

2oSIMS儀器參數(shù)

oSIMS質(zhì)譜及成像通過使用30 keV Bi+3 LMIG，Bi+3離子束束流05 pA，分析區(qū)域?yàn)?0 μm × 60 μm，橫向分辨率為200 nm，256×256像素，周期時(shí)間130 μs，質(zhì)量范圍為0～1600 u。endprint

25oSIMS數(shù)據(jù)分析

oSIMS數(shù)據(jù)由oSIMS自帶軟件SurfaceLab 67進(jìn)行采集及分析，用于質(zhì)量校正的峰為： C+， C2+3及C3+3。

3結(jié)果與討論

31不同基底對(duì)oSIMS脂質(zhì)離子化效率的影響

常規(guī)oSIMS通常被認(rèn)為是“硬電離”技術(shù)，易造成解離分子的嚴(yán)重碎片化而難以得到完整的分子離子峰[27]。近年來，簇狀一次離子源，例如Bi+n、 Au+n、 C+60、Ar+n和（2O）+n等的引入大大減少了對(duì)分子的破壞，提高了分子的離子化效率，使得oSIMS得以較多地應(yīng)用于生物小分子的研究[28～30]。然而，由于基質(zhì)效應(yīng)，處于細(xì)胞中的生物分子離子化效率仍然較低，難以滿足細(xì)胞代謝的研究需求。為了研究基底材料對(duì)脂質(zhì)分子離子化效率的影響，分別測試了硅片、鍍金硅片及加基質(zhì)（DB）的鍍金硅片上磷脂PC （0∶0） 的oSIMS質(zhì)譜圖（圖1）。結(jié)果表明，硅片上PC （0∶0） 準(zhǔn)分子離子峰（m/z 8668， [M+]+）信號(hào)很弱，信噪比低，而在鍍金硅片上準(zhǔn)分子離子峰強(qiáng)度增大為硅片上的20倍，信噪比明顯提高，加入基質(zhì)DB后，分子離子峰信號(hào)增大為硅片上的65倍。結(jié)果表明，鍍金基底對(duì)于磷脂PC （0∶0） 分子的離子化具有明顯的增強(qiáng)作用，在加入基質(zhì)DB后，其離子化效率得到進(jìn)一步的提升，這是因?yàn)橹|(zhì)容易獲得氫質(zhì)子從而正離子化，而2，5二羥基苯甲酸易解離出氫質(zhì)子，而氫質(zhì)子供給脂質(zhì)以及脂質(zhì)碎片，使得脂質(zhì)及脂質(zhì)碎片二次離子產(chǎn)率提高，因此可以提高脂質(zhì)的信號(hào)強(qiáng)度。

32基底及儀器模式對(duì)單細(xì)胞表面脂質(zhì)離子化效率的影響

單細(xì)胞尺寸雖小，但其組成極為復(fù)雜，在單細(xì)胞oSIMS檢測中，復(fù)雜的化學(xué)環(huán)境對(duì)于細(xì)胞成分的離子化效率具有強(qiáng)烈的抑制作用，即所謂“基質(zhì)效應(yīng)”[31]。選擇合適的細(xì)胞培養(yǎng)基底有助于減輕基質(zhì)效應(yīng)，對(duì)于oSIMS單細(xì)胞成分檢測具有重要作用。另外，oSIMS成像中一個(gè)技術(shù)問題是難以同時(shí)獲得高質(zhì)量分辨率和高空間分辨率，這是由于在常規(guī)oSIMS儀器中難以同時(shí)獲得高離子束流和好的離子束聚焦?！把訒r(shí)提取”（DE）模式是一種飛行時(shí)間激光解吸附電離質(zhì)譜技術(shù)中的常用模式，近年來也在oSIMS中有所應(yīng)用，基本原理是使長脈沖一次離子束轟擊樣品表面獲得的二次離子在樣品上方停留一段時(shí)間后再進(jìn)入檢測器，在保證成像質(zhì)量的基礎(chǔ)上提高質(zhì)量分辨率[32]。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了常規(guī)“快速成像”（ast imaging，I）模式與DE模式對(duì)單個(gè)乳腺癌MC7細(xì)胞檢測質(zhì)譜及成像質(zhì)量的影響。如圖2所示，在硅片基底上，DE模式下細(xì)胞表面磷脂PC （3∶1）的準(zhǔn)分子離子峰不僅質(zhì)量分辨率較I模式有較大提高，峰強(qiáng)度也明顯高于I模式。研究表明，DE技術(shù)有利于減少樣品表面凹凸不平帶來的影響[22]，使得更多來自于細(xì)胞邊緣或凹陷處的信號(hào)被檢測到，因此，信號(hào)強(qiáng)度相應(yīng)增強(qiáng)。另外，細(xì)胞表面PC （3∶1）在鍍金硅片上的信號(hào)較硅片上稍有減弱，但在加入基質(zhì)DB后，信號(hào)明顯增強(qiáng)。除了磷脂酰膽堿PC（3∶1）外，其它脂質(zhì)信號(hào)也被增強(qiáng)，如PC（28∶0）、PC（32∶0）、PC（3∶2）、PE（3∶2）、PE（3∶1）、PE（36∶0）等。由于磷脂酰膽堿在細(xì)胞膜中含量較高，相對(duì)于其它脂質(zhì)信號(hào)較強(qiáng)，因此本研究中以磷脂酰膽堿PC（3∶1）作為代表物進(jìn)行分析。與基底上直接滴加待測物不同，細(xì)胞復(fù)雜的化學(xué)環(huán)境使得基底及基質(zhì)的影響大幅減弱，相應(yīng)的信號(hào)放大倍數(shù)也大幅減小。對(duì)于細(xì)胞表面其它成分（如糖類、蛋白質(zhì)等），由于其離子化方式各不相同，對(duì)于可以獲得氫質(zhì)子從而正離子化的成分可以增強(qiáng)其信號(hào)，反之則不能增強(qiáng)。另外，oSIMS具有半定量分析的功能，對(duì)于細(xì)胞表面磷脂可以采用對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行檢測，通過主成分分析可以半定量地比較細(xì)胞表面脂質(zhì)成分的差異性，能夠?qū)σ蚣?xì)胞自身狀態(tài)而導(dǎo)致脂質(zhì)組分的不同做出判斷。

33單細(xì)胞表面脂質(zhì)oSIMS成像研究

為研究不同基底及檢測模式對(duì)于單細(xì)胞脂質(zhì)成像的影響，測定了在硅片、鍍金硅片及鍍金硅片加基質(zhì)情況下磷脂PC頭基（m/z 1810）的成像圖，如圖3所示，并研究了I及DE模式對(duì)于成像的影響。對(duì)比圖3A和3B可知，DE模式下不僅信號(hào)強(qiáng)度比I模式更高，也能更好地展示單細(xì)胞表面細(xì)節(jié)。與圖2一致，圖3C圖中鍍金硅片上的磷脂信號(hào)強(qiáng)度比硅片上稍有下降，但對(duì)于細(xì)胞細(xì)節(jié)的展現(xiàn)有了進(jìn)一步提高。而在加入基質(zhì)后的圖3D圖中，信號(hào)強(qiáng)度提高，但成像質(zhì)量有所下降，這是因?yàn)楸砻娴渭恿艘粚踊|(zhì)，覆蓋了部分細(xì)胞表面的細(xì)節(jié)。結(jié)果表明， DE模式比I模式能更好地展現(xiàn)細(xì)胞表面的細(xì)節(jié)，金基底加基質(zhì)具有最好的離子化效率，但對(duì)成像質(zhì)量有一定的影響，金基底上培養(yǎng)的細(xì)胞具有最好的成像質(zhì)量。值得指出的是，為了保證足夠的成像信號(hào)，每張單細(xì)胞成像圖累計(jì)掃描110次，所需時(shí)間約為937 s，因此可獲得較好的成像質(zhì)量圖。由于oSIMS高真空檢測環(huán)境的限制，本方法只適用于單細(xì)胞的離線分析，尚不能進(jìn)行單細(xì)胞動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)分析。

結(jié) 論

本研究測定了在不同基底上單細(xì)胞表面脂質(zhì)的oSIMS離子化效率，表明金屬及基質(zhì)對(duì)脂質(zhì)離子化具有增強(qiáng)作用，與新型離子源、激光輔助后電離以及其它基質(zhì)增強(qiáng)等方法相比，金屬/基質(zhì)增強(qiáng)的方法具有增強(qiáng)效果較好、無需更改現(xiàn)有的儀器裝置、樣品制備簡單、不改變細(xì)胞冷凍干燥前的狀態(tài)等優(yōu)勢。而只用金膜作為基底結(jié)合使用“延時(shí)提取”技術(shù)既能同時(shí)保留oSIMS成像的高質(zhì)量分辨率與空間分辨率，還能提高表面不平整樣品的成像質(zhì)量，在細(xì)胞表面滴加基質(zhì)2，5二羥基苯甲酸后，更進(jìn)一步提高了細(xì)胞表面磷脂二次離子信號(hào)。金屬/基質(zhì)增強(qiáng)的方法主要通過將基質(zhì)覆蓋于細(xì)胞膜表面，以氫質(zhì)子傳遞以及貴金屬增強(qiáng)來提高脂質(zhì)二次離子產(chǎn)率，而貴金屬與基質(zhì)沒有接觸到細(xì)胞內(nèi)部，因此本方法對(duì)于細(xì)胞內(nèi)部組分信號(hào)提高效果不明顯，如果將基質(zhì)覆蓋細(xì)胞內(nèi)部，有望進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)部組分信號(hào)。 本研究結(jié)果為單細(xì)胞oSIMS分析獲得高質(zhì)量成像圖提供了有效途徑，為細(xì)胞代謝、細(xì)胞藥物成像等研究提供了新的方法。endprint

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Abstracthe chemical components analysis of single cell is important for understanding of physiological processes such as cell growth， signal transduction and apoptosis imeofflight secondary ion mass spectrometry （oSIMS） is a sensitive surface analysis technique with high spatial resolution and can be used for single cell and microarea analysis owever， relatively low ionization yield of biomolecules limited its wide application in single cell analysis erein， we used metal substrate and matrix material to enhance the ionization yield of lipids he signal intensity of the phosphatidylcholine PC （0∶0） casted on the matrix/gold coated silicon substrate was 65 times higher than that on the silicon wafer Signal enhancement of phosphatidylcholine PC （3∶1） on the single cell surface cultured on matrix/gold coated silicon substrate was observed as well Due to the influence of irregular topography and complex chemical environment of cell， the increase of lipids signal was smaller Delayed extraction mode of oSIMS overcame the effects of cell topography， leading to further enhancement of the signal intensity of lipids Meanwhile， simultaneous high spatial resolution of chemical imaging and high mass resolution of the mass spectra of single cells were obtained Our strategies provided new insights into the study of cell metabolism and cellenvironment interactions

KeywordsSingle cell analysis； Lipids； imeofflight secondary ion mass spectrometry； Noble metal/matrix enhancement； Mass spectrometry imagingendprint