筱 禾 編譯

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微生物組促進(jìn)害物抗性的產(chǎn)生和應(yīng)用

筱 禾 編譯

(上海市農(nóng)藥研究所，上海 200032)

1 微生物組(microbiomes)

對(duì)與真核生物生態(tài)相關(guān)并在真核生物中發(fā)揮各種功能的細(xì)菌、真菌、病毒和古細(xì)菌微生物組的研究目前非常流行，尤其是與人類微生物組相關(guān)的。最近創(chuàng)建的術(shù)語(yǔ)微生物組包括腸道微生物，共生微生物的整體生物群落，表面微生物，根際微生物、根表微生物和根系內(nèi)生菌等。下文僅就有害生物的微生物組與害物的關(guān)系對(duì)害物治理的影響，即作為除草劑代謝和殺蟲劑抗性的一種模式進(jìn)行討論。此外，簡(jiǎn)要描述了微生物組生物體在作物和有益昆蟲中的應(yīng)用前景，或可用于增強(qiáng)化學(xué)合成農(nóng)藥的藥效或提高農(nóng)藥選擇性。微生物組能夠影響農(nóng)藥的作用并不稀奇，已有許多研究記載了人類腸道微生物組如何影響藥物功效。

2 微生物可降解農(nóng)藥

在討論微生物組生物體是否影響害物治理之前，需要強(qiáng)調(diào)的是與微生物組無(wú)直接相關(guān)性的微生物明顯具有這種作用。眾所周知，微生物降解是環(huán)境中農(nóng)藥消解的主要途徑。降解速度的不同，在某些情況下會(huì)引發(fā)問(wèn)題。30多年前，當(dāng)在某種植季為防治昆蟲和雜草頻繁、大量應(yīng)用殘效較長(zhǎng)的土壤處理除草劑和殺蟲劑時(shí)，出現(xiàn)了所謂的“問(wèn)題土壤”。這種缺乏長(zhǎng)期防治的原因并不是由于有害生物出現(xiàn)了抗性。大多數(shù)情況是由于富集的土壤微生物降解了殺蟲劑和除草劑。反之，大多數(shù)用于抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的基因來(lái)源于土壤微生物，通常是從有除草劑殘留的土壤中分離所得。蘇云金芽孢桿菌菌株在有機(jī)農(nóng)業(yè)中用作殺蟲劑，其毒素基因被轉(zhuǎn)基因?qū)朐S多作物中，通常是葉面定殖生物體，但一般是從土壤中落葉凋落物中分離所得。

3害物微生物組生物體降解環(huán)境異生物質(zhì)(environmental xenobiotics)

越來(lái)越多的報(bào)道表明，害物對(duì)非商業(yè)性殺蟲劑類異生物質(zhì)的抗性不屬于害物基因組機(jī)制，而是微生物組生物體。下面舉例說(shuō)明。

咖啡因具有很高的殺蟲活性，研究人員試圖找到造成危害全球咖啡種植園的咖啡果小蠹()出現(xiàn)抗性的基因。令他們驚訝的是，無(wú)菌(axenic)咖啡果小蠹幼蟲很容易被低劑量的咖啡因滅殺，追蹤到該基因位于微生物組組合體中的一個(gè)特異生物體中，而不是咖啡果小蠹的基因。因?yàn)殚蠙煜?)幼蟲對(duì)毒性酚苷橄欖苦苷(oleuropein)敏感，故其應(yīng)不能存活于橄欖果實(shí)。橄欖蠅自橄欖果實(shí)表面獲得細(xì)菌，經(jīng)由一種尚未闡明的機(jī)制使橄欖蠅對(duì)橄欖苦苷產(chǎn)生抗性。最近已論述了許多昆蟲微生物組的類似情況。同樣，松材線蟲()不具備降解蒎烯(pinene)的能力，但其在松樹中泛濫。這種對(duì)萜類降解能力再次源于它們的微生物組。

在生物防治失控的情況下，從夏威夷將甘蔗蟾蜍()引入澳大利亞，以防治危害甘蔗的本土Frenchi甲蟲()和灰背甘蔗甲蟲()。80年前，主要使用砷類殺蟲劑來(lái)防治甲蟲。甘蔗蟾蜍頭部的毒腺分泌可殺死本土天敵及寵物的心臟毒素(cardiotoxin)，導(dǎo)致本地物種的大量消失。研究人員最近研究了該毒素對(duì)蟾蜍卵和蝌蚪或蟾蜍本身沒(méi)有毒性的原因。他們發(fā)現(xiàn)微生物組生物體能夠降解毒素，而蟾蜍用這些生物體將卵包裹起來(lái)。

據(jù)報(bào)道，植物也可利用微生物組生物體保護(hù)自身免受異生物質(zhì)影響。例如，根瘤菌雅致放射毛霉(s)可保護(hù)苘麻()免受由黑麥產(chǎn)生的化感物質(zhì)——苯并噁唑啉-2(3)-酮的危害。

4 微生物組生物體降解害物體內(nèi)農(nóng)藥

考慮到微生物組與寄主互利共生的長(zhǎng)期進(jìn)化史，它們對(duì)殺蟲劑有相同的作用并不意外。40年前報(bào)道了首例微生物組促進(jìn)抗性產(chǎn)生，之后被遺忘了30多年。后來(lái)有報(bào)道，蘋果實(shí)蠅()微生物組中共生細(xì)菌假單胞菌()能降解6種不同的殺蟲劑，使這些殺蟲劑不能用于防治蘋果實(shí)蠅。除了1994年有人提出昆蟲內(nèi)生物體的“共代謝降解”可能是農(nóng)藥快速降解的一個(gè)可能原因之外，微生物組促進(jìn)抗性的可能性大多被忽略。

只有在近5年來(lái)才有更多的情況被揭露。腸道共生體檸檬酸桿菌(sp.)某個(gè)菌株的基因編碼的磷酸酶羥化酶可降解橘小實(shí)蠅()體內(nèi)的有機(jī)磷類殺蟲劑敵百蟲，導(dǎo)致防效下降。同樣，危害豆科作物的點(diǎn)蜂緣蝽()的共生細(xì)菌伯克氏菌()可降解殺蟲劑殺螟松，使害蟲存活。這些細(xì)菌也存在于土壤中，表明它們可能會(huì)將對(duì)這種殺蟲劑的抗性傳給其他攝入它們的昆蟲。這需要生物體能夠在微生物組中確立不被已經(jīng)存在的生物體所抑制的能力。降解機(jī)制尚未深入研究，因此很少或根本沒(méi)有與殺蟲劑交互抗性相關(guān)的信息，這對(duì)于抗性治理來(lái)說(shuō)非常重要。從小菜蛾()腸道中分離出的多種細(xì)菌能夠降解殺蟲劑茚蟲威和乙酰甲胺磷，但還有待證明它們會(huì)導(dǎo)致原位抗性。最近已有文章綜述了許多此類有關(guān)昆蟲微生物組的案例。

除草劑禾草靈通常不用于土壤處理，因此以下例子描述非農(nóng)情況，可能出現(xiàn)的情況。在禾草靈處理后，根際細(xì)菌豐度增加，保護(hù)了對(duì)該藥劑敏感的水稻植株。真菌內(nèi)生菌似乎與多花黑麥草()對(duì)禾草靈的抗性相關(guān)，但沒(méi)有用真菌耐藥品系接種植物易感品系的試驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)證明。

賦予許多已進(jìn)化代謝抗性的雜草基因尚未被分離或克隆。盡管抗性遺傳學(xué)并不完全清楚，但這種雜草編碼基因?qū)嶋H上并不存在的可能性直到最近才被質(zhì)疑。這種遺傳不是單基因的，其多基因遺傳可能由其他因素引起。最近的2項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)耐藥性雜草的內(nèi)生真菌數(shù)量高于易感種群。多花黑麥草的內(nèi)生細(xì)菌很少，但與對(duì)草甘膦的抗性顯著相關(guān)。已報(bào)道在非靶標(biāo)抗性看麥娘()、硬直黑麥草()和草甸羊茅()中存在內(nèi)生雙分病毒科(Partititiviridae)和彈狀病毒科(Rhabdoviridae)的病毒。在測(cè)試的任何除草劑敏感生物型植物中未發(fā)現(xiàn)看麥娘葉脈曲張病毒1 (AMVV1)，但在耐受種群中的大多數(shù)植物中發(fā)現(xiàn)了。這2種情況下都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何直接的因果關(guān)系，因?yàn)樯形聪驅(qū)Τ輨┟舾械纳镄徒臃N這些生物體，以確定它們是否賦予抗性，或者細(xì)菌抗生素或抗病毒處理能否消除抗性。

昆蟲腸道中含有微生物組生物體，植物具有體表微生物組(根際生物體以及葉片和果實(shí)表面的微生物)以及內(nèi)生微生物組(內(nèi)生菌)。昆蟲和雜草中的更多微生物組能否降解殺蟲劑和除草劑有待時(shí)間來(lái)證明。一種可能性推測(cè)是，同樣影響微生物自身代謝的農(nóng)藥最有可能首先出現(xiàn)這種進(jìn)化，如抑制氨基酸生物合成途徑的除草劑。進(jìn)一步假設(shè)它們進(jìn)化后對(duì)異生物質(zhì)具有解毒作用，且不直接影響自身但能挽救其寄主。但這個(gè)假設(shè)可能有爭(zhēng)議，咖啡因、咖啡果小蠹和歐文氏菌的情況就是如此。目前沒(méi)有這方面的證據(jù)支持，也不可能，因?yàn)榭Х纫蚰芤种婆c歐文氏菌近緣的大腸桿菌。如果微生物組生物體產(chǎn)生靶位點(diǎn)抗性，不太可能挽救其寄主。只有代謝抗性或螯合才會(huì)使寄主產(chǎn)生抗性。

預(yù)測(cè)還有一種可能性，即昆蟲腸道細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生降解被用作殺蟲劑的各種蘇云金芽孢桿菌毒素的蛋白酶，因?yàn)檫@些殺蟲劑很容易成為這些細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。任何時(shí)候一種生物體被一種農(nóng)藥所抑制，很可能會(huì)產(chǎn)生抗性，而已知這些Bt毒素可影響昆蟲腸道內(nèi)的微生物群落結(jié)構(gòu)。

其中一些微生物組促進(jìn)的抗性可能遺傳，因?yàn)榧?xì)菌會(huì)從母體傳播至害物的卵或種子表面。確定抗性是來(lái)自害蟲基因組還是微生物組基因組的最簡(jiǎn)單方法是使用無(wú)菌害物，或用抗生素處理害物，并觀察抗性是否保持不變。上述抗性不符合抗性應(yīng)是害物基因組內(nèi)遺傳的傳統(tǒng)定義。由于田間的這種防治失效(lack of control)不符合抗性定義，有人提議將定義修改為包括其他類型的防治失效。對(duì)種植者來(lái)說(shuō)，肯定無(wú)法理解由微生物組引起的防治失效不是抗性。這個(gè)例子說(shuō)明內(nèi)吸性殺菌劑和抗菌化合物可作為農(nóng)藥增效劑來(lái)預(yù)防或克服微生物組促進(jìn)的農(nóng)藥抗性。

癌細(xì)胞可被視為有害生物，或者至少與它們類似，而抗癌藥物即等同于農(nóng)藥。令人驚訝的是已經(jīng)觀察到一些癌細(xì)胞的胞內(nèi)細(xì)菌微生物組可降解抗癌藥物2',2'-二氟脫氧胞苷(2′,2′-difluorodeoxycytidine)，導(dǎo)致耐藥性。通過(guò)給予抗生素和化學(xué)治療劑來(lái)克服這種耐藥性。

有一種可能性假設(shè)，即一些原因不明的嚙齒動(dòng)物對(duì)抗凝血?dú)⑹髣┑目剐栽从谖⑸锝M。微生物組通常為哺乳動(dòng)物提供抗凝血?jiǎng)┑慕舛緞S生素K。富含維生素K的生物體可能會(huì)賦予抗藥性。利用抗生素壓制應(yīng)用抗凝血?jiǎng)﹚arfarin病人的腸道生物群常常會(huì)導(dǎo)致這種抗凝劑的過(guò)量，危及生命。將應(yīng)用高劑量抗凝血?jiǎng)﹚arfarin的人的排泄物飼喂小鼠，小鼠會(huì)產(chǎn)生warfarin耐藥性，表明了由排泄物攝入引起嚙齒動(dòng)物對(duì)抗凝血?jiǎng)┊a(chǎn)生抗性的一種可能途徑。

目前有關(guān)微生物組促進(jìn)抗性產(chǎn)生的報(bào)道很少。人們?cè)陔s草和昆蟲基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄分析和代謝組學(xué)方面投入了大量精力，但代謝抗性的許多案例的確切原因尚未闡明。也許這要?dú)w咎于研究的是有害生物的而非微生物組的基因組、基因及其產(chǎn)品。

尋找抗性基因的第一步，往往是從抗性與敏感個(gè)體的轉(zhuǎn)錄組分析開始，觀察哪些基因在抗性害物中產(chǎn)生了差異化的mRNA。粗RNAs是從兩者中提取的，然后過(guò)親和柱將結(jié)合mRNAs poly (A)尾巴的害蟲mRNAs從其余的RNAs中分離出來(lái)。然后對(duì)這些poly (A)mRNAs進(jìn)行洗脫和分析。有一個(gè)可能的問(wèn)題，即只有真核mRNA具有一個(gè)ploy (A)尾巴，因此細(xì)菌、病毒、線粒體和葉綠體的轉(zhuǎn)錄體mRNA在分析中被丟棄。

現(xiàn)在的研究方法保留了non-poly(A) mRNA。目前有幾種從害物中分離微生物mRNA的方法，包括商業(yè)試劑盒，本文旨在提醒讀者在農(nóng)藥抗性情況下這樣做的必要性。

5 微生物組生物體賦予抗性在作物中的應(yīng)用和益處

令人懷疑的是，自然發(fā)生的內(nèi)生細(xì)菌和/或真菌本身是否能賦予寄主對(duì)異生物質(zhì)產(chǎn)生足夠的抗性。那些可能有用的微生物是典型特異性物種，而不是需要耐受性的物種。其他種類對(duì)農(nóng)藥的降解速度不夠快，無(wú)法產(chǎn)生抗性。例如，將一個(gè)編碼甲苯降解途徑基因的質(zhì)粒從沒(méi)有定殖于黃羽扇豆的伯克霍爾德菌()菌株轉(zhuǎn)移到定植的菌株上，“明顯”降低了甲苯對(duì)植物的毒性。顯然，在存在甲苯土壤污染問(wèn)題的情況下，還有更多的事情要做。這些問(wèn)題很有可能通過(guò)基因工程，提高微生物的降解性能而得到解決。

多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)驗(yàn)證了降解農(nóng)藥的生物體賦予昆蟲耐藥性的可能性。在殺蟲劑處理前，向模式昆蟲果蠅飼喂與有機(jī)磷殺蟲劑對(duì)硫磷和毒死蜱結(jié)合的鼠李糖乳桿菌()，果蠅則對(duì)這2種殺蟲劑具有一定的抗性。有一種感染蚜蟲的內(nèi)共生體的溶原性噬菌體，可保護(hù)蚜蟲不受寄生蜂的侵害。這種噬菌體與感染其他微生物組共生體的噬菌體密切相關(guān)。可以設(shè)想這種噬菌體可被用來(lái)感染有益昆蟲的微生物或?qū)⑵浠蜣D(zhuǎn)入這些昆蟲，在昆蟲體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生內(nèi)源性噬菌體。在一項(xiàng)專利申請(qǐng)中(目前還不清楚是否有實(shí)際證據(jù)表明已經(jīng)做到了這一點(diǎn))也提出，蜜蜂和其他理想昆蟲的微生物組生物體可被設(shè)計(jì)用來(lái)降解新煙堿類殺蟲劑。

某些植物假單胞菌菌株和種能產(chǎn)生抗菌、殺菌和殺蟲的化學(xué)物質(zhì)。近來(lái)有人建議更廣泛地使用這些物質(zhì)，特別是用于害蟲防治。盡管它們被宣傳為環(huán)境友好和天然的，但不能保證它們制成的化學(xué)品是安全的，而且據(jù)推測(cè)，管理機(jī)構(gòu)將會(huì)像審查化學(xué)合成農(nóng)藥一樣對(duì)它們進(jìn)行審查。侵染番茄的假單胞菌可使寄生雜草埃及肉蓰蓉()的萌發(fā)率降低80%。這種雜草每株即能產(chǎn)生數(shù)以萬(wàn)計(jì)的種子，因此該菌目前還不足以用于害物治理。盡管如此，可以通過(guò)基因工程增強(qiáng)這種假單胞菌的毒性，使其發(fā)揮更大的作用。

在最近的一篇綜述中，對(duì)利用基因工程改造內(nèi)生菌賦予植物除草劑抗性的可能性進(jìn)行了大量的討論，列舉了可用于開發(fā)新除草劑抗性體系的無(wú)數(shù)具體代謝體系和基因的實(shí)例。

有2種人工將內(nèi)生菌引入作物用于大規(guī)模農(nóng)業(yè)的方法。一種方法是利用高壓將內(nèi)生菌引入種子。這種方法被用于向玉米引入一種可生成具殺蟲活性Bt毒素的基因工程改造內(nèi)生菌。在多年/地點(diǎn)的田間試驗(yàn)中，該處理可使玉米螟的危害下降2/3左右。由于防效帶來(lái)的產(chǎn)量增加不足以彌補(bǔ)成本，這種方法與殺蟲劑不存在競(jìng)爭(zhēng)性。另一種接種方法是向植物的花噴灑接種體引入內(nèi)生菌，且轉(zhuǎn)基因標(biāo)記存在于后代中。目前還沒(méi)有害物治理相關(guān)基因利用該技術(shù)進(jìn)行了試驗(yàn)的報(bào)道。

似乎更容易將微生物組生物體應(yīng)用于昆蟲，無(wú)論是直接用于卵或是幼蟲。

6 結(jié) 語(yǔ)

顯而易見(jiàn)，一些研究害蟲對(duì)環(huán)境異生物質(zhì)和殺蟲劑的抗性進(jìn)化的研究人員已經(jīng)重現(xiàn)了Pasteur和Lister的研究，需要了解微生物作用和無(wú)菌系統(tǒng)的重要性。人們常常認(rèn)為，如果將植物、嚙齒類動(dòng)物或昆蟲組織研磨后研究代謝，所闡明的代謝途徑即是這些生物代謝的結(jié)果。很少有研究人員會(huì)檢查微生物污染，或者用無(wú)菌害物來(lái)確定抗性是否確實(shí)屬于害蟲自身，而不是它的微生物組。微生物組生物體的種群密度時(shí)高時(shí)低，類似于可隨著選擇壓力的增加而增加的表觀遺傳抗性，在后代中偶爾會(huì)被“遺忘”，可能導(dǎo)致被誤認(rèn)為偶發(fā)(sporadic)抗性。同樣，一些研究人員沒(méi)有遵循柯赫氏假設(shè)(Koch’s postulates)，將有微生物組和無(wú)微生物組的物種個(gè)體間的代謝差異與微生物組聯(lián)系起來(lái)。無(wú)需侵染無(wú)菌菌株，已用抗性個(gè)體的微生物組進(jìn)行了研究，以確定它們是否獲得了這種性能。

過(guò)去，研究人員不想發(fā)表孟德爾遺傳學(xué)無(wú)法解釋的偶發(fā)抗性案例結(jié)果。因此造成了對(duì)某些由表觀遺傳因素引起的抗性的認(rèn)識(shí)滯后。期望現(xiàn)在已沒(méi)有了這種想法，那么，人們會(huì)看到更多有關(guān)微生物組抗性的報(bào)道，即使它不符合對(duì)抗性的現(xiàn)行定義。

盡管存在上述弊端和限制，但似乎有大量證據(jù)表明，某些對(duì)異生物質(zhì)和農(nóng)藥的抗性來(lái)源于微生物組，從事害物治理的科研人員應(yīng)該意識(shí)到這種可能性。有證據(jù)表明，微生物組生物體在脅迫條件下的種群密度更大。考慮到氣候的波動(dòng)和變化所帶來(lái)的脅迫，可能會(huì)看到更多受微生物組影響的抗性。就像可利用抗生素同時(shí)治療來(lái)防止哺乳動(dòng)物腸道或細(xì)胞內(nèi)腫瘤微生物組對(duì)藥效的不利影響一樣，可設(shè)想在害蟲微生物組中能發(fā)現(xiàn)和開發(fā)防止農(nóng)藥代謝的增效劑。

利用微生物作為生物防治劑來(lái)保護(hù)農(nóng)作物免受害物危害還處于一個(gè)較長(zhǎng)的起步階段，前景光明，但目前還沒(méi)有準(zhǔn)備開展大規(guī)模的田間推廣。大多數(shù)商業(yè)化的生物防治劑的應(yīng)用僅限于條件可控的溫室。如何增強(qiáng)它們的毒性，在種植體系中保持所接種有益微生物組的穩(wěn)定種群，并制備有效的制劑，使它們能夠在田間得到有效利用，任重道遠(yuǎn)。

筱禾，女，工程師。Tel: 021-64387891-201。

2018-04-12。

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2018.02.08

TQ450

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1009-6485(2018)02-0039-04