杜鵑花種質(zhì)資源的收集保存、鑒定評(píng)價(jià)及創(chuàng)新利用綜述

劉曉青， 蘇家樂(lè)， 李 暢， 何麗斯， 肖 政

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院休閑農(nóng)業(yè)研究所，江蘇南京 210014)

杜鵑花是杜鵑花科(Ericaceae)杜鵑花屬(Rhododendron)的著名觀賞植物，它不僅是我國(guó)十大名花之一，也是世界三大著名高山花卉之一[1]。杜鵑花品種繁多、花色艷麗、花期長(zhǎng)久、寓意吉祥，不僅可以作為盆栽供應(yīng)年宵花市場(chǎng)，也可以露地栽培成為園林綠化美化的重要材料，發(fā)展前景十分廣闊。

1 種質(zhì)資源的收集與保存

1.1 種質(zhì)資源概述

杜鵑花屬是一個(gè)大屬，有1 000種左右，分布于亞洲、北美洲和歐洲，起源于距今6 700萬(wàn)年至13 700萬(wàn)年的白堊紀(jì)[1-2]，其中亞洲分布最多，約有850種，中國(guó)有560余種，僅云南、西藏和四川就有403種，是世界杜鵑花的發(fā)祥地和現(xiàn)代分布中心。經(jīng)近代植物學(xué)家調(diào)查，中國(guó)杜鵑花的分布現(xiàn)已基本清楚，以長(zhǎng)江為界，長(zhǎng)江以南種類(lèi)較多，長(zhǎng)江以北較少。全國(guó)除新疆、寧夏等干旱荒漠地帶外，其他各省份皆有分布[2]。

我國(guó)是世界上最早記載和利用杜鵑花資源的國(guó)家，早在公元492年就有關(guān)于羊躑躅命名的記載，比瑞典早1 250多年。而日本引種中國(guó)杜鵑花當(dāng)推至唐朝，并將其與本土杜鵑雜交，培育出大量品種。至于歐美，則從1843年開(kāi)始于云南采集各種野生杜鵑花及種子[2]。

我國(guó)園藝學(xué)家通常將杜鵑花栽培品種，據(jù)形態(tài)、性狀、親本和來(lái)源劃分為東鵑、夏鵑、毛鵑、西鵑和所謂的“高山杜鵑”[3]。東鵑主要是石巖杜鵑(R.obtusum)的變種及其眾多雜交后代的總稱(chēng)，因源自日本，與西洋杜鵑對(duì)應(yīng)特稱(chēng)東洋鵑，簡(jiǎn)稱(chēng)東鵑，主要特征是體型矮小，分枝多密，著花繁茂，花朵較小，一般花徑2～4 cm，最大至6 cm，單瓣或由花萼瓣化而成套筒瓣，少有重瓣[4]。夏鵑指初夏開(kāi)花的一類(lèi)，以日本的皋月杜鵑(R.indicum)作為親本選育而成。西鵑又稱(chēng)比利時(shí)杜鵑，系指荷蘭、比利時(shí)等國(guó)利用皋月杜鵑、映山紅和白毛杜鵑等經(jīng)反復(fù)雜交育成的一類(lèi)花色艷麗、花期較長(zhǎng)的品種。而“高山杜鵑”則主要指利用常綠杜鵑亞屬的種質(zhì)資源類(lèi)型育成的一些葉革質(zhì)、常綠、花葉碩大的品種類(lèi)型。

1.2 種質(zhì)資源收集與圃地保存

對(duì)于野生資源，早在19世紀(jì)，國(guó)外就有許多規(guī)模較大的植物園用以保存杜鵑花活體植株，保育數(shù)量較多的依次有英國(guó)的愛(ài)丁堡植物園、美國(guó)的杜鵑花植物種植園、英國(guó)的布魯?shù)峡顺潜@、英國(guó)的英威園和美國(guó)的阿諾德樹(shù)木園[2]。此外，保育杜鵑花種類(lèi)百種以上的植物園在澳大利亞和日本也并不少見(jiàn)。國(guó)內(nèi)則從20世紀(jì)60年代開(kāi)始了對(duì)杜鵑花野生資源的引種馴化研究，目前昆明植物園已成功引種馴化并保存141種云南野生常綠杜鵑花。此外，廬山植物園、井岡山園林所、貴州植物園、杭州植物園、沈陽(yáng)園林科研所、中國(guó)科學(xué)院植物所、華西植物園等也進(jìn)行了杜鵑花的遷地保護(hù)研究[1]。20世紀(jì)80年代初，由中國(guó)科學(xué)院廬山植物園與昆明植物園共同開(kāi)展了我國(guó)杜鵑花屬植物資源的搜集與保育工作，搜集了國(guó)產(chǎn)杜鵑花資源300種以上，成功保育率分別約為70%和50%[2，5]。之后，中國(guó)科學(xué)院植物所華西亞高山植物園經(jīng)過(guò)20余年的堅(jiān)持，搜集保育的種類(lèi)達(dá)360種。此外，保育種類(lèi)在50～70種的機(jī)構(gòu)還有井岡山園林所、重慶南山植物園、貴州植物園、中國(guó)科學(xué)院華南植物園和湖南森林植物園等[2]。

對(duì)于品種資源，自20世紀(jì)20年代起，我國(guó)沿海城市如上海、寧波、青島、丹東等地的部分民間杜鵑花愛(ài)好者就通過(guò)各種渠道從國(guó)外引進(jìn)杜鵑花園藝品種(現(xiàn)今這些地方大部分成為國(guó)內(nèi)杜鵑花的主要產(chǎn)區(qū)和栽培應(yīng)用區(qū))，其中比較著名的有無(wú)錫的沈淵如先生、上海的黃岳淵先生等，累計(jì)共引種杜鵑花品種1 000余種，包括毛鵑30余種、夏鵑700余種、東鵑500余種及西洋鵑近100種，但抗日戰(zhàn)爭(zhēng)期間，大多品種遭到破壞而流失[4]。目前，國(guó)內(nèi)品種保有量比較大的單位有無(wú)錫錫惠公園杜鵑園、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所、浙江省金華市永根杜鵑花培育有限公司等。其中，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所從2005年開(kāi)始杜鵑花種質(zhì)資源的收集保存、鑒定評(píng)價(jià)及種質(zhì)創(chuàng)新研究，到目前為止，共引進(jìn)杜鵑花資源400余份，其中野生資源59份，品種資源356份(囊括各大品種群)。2016年10月，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所被中國(guó)花卉協(xié)會(huì)認(rèn)定為首批國(guó)家杜鵑花種質(zhì)資源庫(kù)，同時(shí)被認(rèn)定的還有浙江省金華市永根杜鵑花培育有限公司。

1.3 品種繁育

引入的資源中有部分是采用枝條形式，有部分采用的是種子形式，因此需進(jìn)行扦插、嫁接或播種繁殖。此外，對(duì)有推廣利用價(jià)值的品種也需進(jìn)行規(guī)?；旆?。目前扦插是繁殖杜鵑花最常用的一種方法，國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的園藝栽培品種，大多以扦插繁殖為主，品種的扦插繁殖比野生資源容易，目前大部分Azalea品種類(lèi)群皆可以通過(guò)激素處理或者直接扦插而取得較好的生根效果[6-10]。有關(guān)杜鵑野生資源扦插繁殖的研究?jī)H局限在幾個(gè)種，如淀川杜鵑、毛棉杜鵑、鹿角杜鵑、糙葉杜鵑、興安杜鵑、長(zhǎng)蕊杜鵑、大白杜鵑和美容杜鵑等，對(duì)其扦插繁殖技術(shù)的探討主要集中在不同的激素種類(lèi)濃度及扦插基質(zhì)對(duì)生根的影響，采用的激素種類(lèi)主要以吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)和α-萘乙酸(NAA)等為主[11-17]。而對(duì)于高山常綠闊葉杜鵑品種(種)的組培快繁，國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究頗多，技術(shù)已經(jīng)非常成熟，外植體可以是莖段、嫩葉、花苞，生根方式可以在試管內(nèi)也可以在試管外，這為國(guó)內(nèi)高山杜鵑的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)[18-28]。

1.4 種質(zhì)離體保存

由于田間保存方式所需較大空間及人力物力支出，且存在物種因自然災(zāi)害等原因而遺失等缺陷，杜鵑種質(zhì)的離體保存工作有著重要意義。除了種質(zhì)的圃地保存外，可通過(guò)離體培養(yǎng)方式保存種質(zhì)，國(guó)內(nèi)外也有杜鵑花種質(zhì)離體保存的相關(guān)研究報(bào)道。顧地周等[29-32]、梁宇等[33]用小葉杜鵑、苞葉杜鵑、牛皮杜鵑、照白杜鵑、短果杜鵑的嫩芽為外植體，DR培養(yǎng)基為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基為生根及保存的基本培養(yǎng)基，通過(guò)低營(yíng)養(yǎng)、常溫矮化延緩生長(zhǎng)等措施，輔以IAA、NAA等生長(zhǎng)素及根皮苷，可使杜鵑花野生種質(zhì)的試管內(nèi)保存期限達(dá)到8～35個(gè)月不等，其中短果杜鵑的離體試管保存時(shí)間可達(dá)40個(gè)月之久，這為某些瀕危種質(zhì)的保存與保護(hù)提供了新的思路與技術(shù)手段。

2 鑒定評(píng)價(jià)

2.1 抗性評(píng)價(jià)

耐熱性方面，杜鵑屬植物不同亞屬、組、種乃至品種的耐熱性都不同，同一個(gè)種因來(lái)源、產(chǎn)地等的不同耐熱性也有差異[34]。有研究表明過(guò)氧化氫(H2O2)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)及丙二醛(MDA)等與杜鵑耐熱性密切相關(guān)，可以用于杜鵑耐熱性的鑒定[35]。但張春英等在對(duì)4種常綠杜鵑花葉片耐熱性的指標(biāo)研究中發(fā)現(xiàn)葉片氣孔總面積、細(xì)胞膜相對(duì)透性、游離脯氨酸含量與植物耐熱性存在相關(guān)性，氣孔密度、超氧化物歧化酶活性與植物耐熱性無(wú)相關(guān)性[36]。

杜鵑的抗寒性是與自然分布區(qū)中冬季溫度密切相關(guān)，抗寒種類(lèi)一般起源于高寒地區(qū)[37]。有報(bào)道表明，部分品種能夠耐-40 ℃的低溫，而二倍體杜鵑品種比四倍體品種更加耐寒[38]。耐寒的杜鵑品種不僅在葉片結(jié)構(gòu)上存在一些共同的形態(tài)特征[39]，并且在低溫適應(yīng)過(guò)程中，可以通過(guò)提高體內(nèi)膜保護(hù)系統(tǒng)的活性來(lái)清除活性氧，降低MDA在體內(nèi)積累，防止膜脂過(guò)氧化作用，維持膜結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性[40]?？购霹N品種自身或在耐寒適應(yīng)過(guò)程中會(huì)積累較多的不飽和脂肪酸，而膜脂脂肪酸不飽和度和磷脂酰甘油的飽和脂肪酸水平可作為抗寒性鑒別較為可靠的生理指標(biāo)，低溫半致死溫度可以準(zhǔn)確直觀地反映杜鵑的耐寒性[41]。

不同杜鵑品種之間耐旱性存在顯著差異，這與其須根的發(fā)達(dá)程度密切相關(guān)[42]，西洋杜鵑和毛鵑對(duì)干旱脅迫有較好的適應(yīng)性，并且西洋杜鵑比毛鵑能更好地適應(yīng)干旱環(huán)境[43]。高山杜鵑在輕度干旱脅迫下，一般水分利用效率(WUE)沒(méi)有顯著變化，干旱脅迫嚴(yán)重時(shí)，WUE值顯著下降，葉片MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率顯著增加，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重[44-45]，而此過(guò)程中MDA和保護(hù)酶活性與高山杜鵑抗旱性密切相關(guān)，可以作為杜鵑耐旱性的評(píng)價(jià)指標(biāo)[46]。

2.2 土壤適應(yīng)性評(píng)價(jià)

杜鵑花適合在pH值4.0～6.0的土壤中生長(zhǎng)，多數(shù)種的最適pH值為4.5～5.5[47]。如興安杜鵑和迎紅杜鵑2年生實(shí)生苗在pH值5.5的基質(zhì)中生長(zhǎng)狀態(tài)最佳[48]。鹿角杜鵑，馬銀花，映山紅等杜鵑種子萌發(fā)的適宜pH值為5.0～6.5[49]。因此，杜鵑花屬植物被認(rèn)為是典型的酸性土壤指示植物，喜酸怕堿的栽培要求是限制杜鵑花在中性或堿性土質(zhì)中應(yīng)用的一個(gè)重要因子。但也有一些杜鵑品種有一定的耐堿性，如云錦杜鵑等[50]。

3 種質(zhì)創(chuàng)新

3.1 常規(guī)育種

從國(guó)際登記調(diào)查看，絕大多數(shù)杜鵑新品種來(lái)自自然或人工雜交實(shí)生苗及芽變苗的選育。隨著杜鵑在世界傳播及觀賞利用價(jià)值的發(fā)展，人工雜交育種也深入開(kāi)展。第1個(gè)杜鵑花雜交種在英國(guó)產(chǎn)生，記錄為azaleodendron，是黃焰杜鵑花和秋花杜鵑的一個(gè)隨意雜交種。1860年以后，許多英國(guó)植物采集者采走中國(guó)大量的杜鵑花資源，如由羅伯特·福瓊1856年在中國(guó)發(fā)現(xiàn)并命名的云錦杜鵑(Rhododendronfortunei)，被認(rèn)為是中國(guó)最好的杜鵑，成為20世紀(jì)杜鵑花育種中最著名親本之一[51]。到目前為止，國(guó)外已培育出了耐寒、大花、早花、晚花和香花品種。

國(guó)內(nèi)杜鵑花的育種工作與國(guó)外相比差距較大，到2004年為止，只有34個(gè)品種進(jìn)行了登記[2]。杜鵑花的育種工作也是在20世紀(jì)80年代才開(kāi)始的，且多為引種繁育的研究。張長(zhǎng)芹等對(duì)杜鵑花的雜交育種技術(shù)進(jìn)行了嘗試，在杜鵑花屬的59對(duì)雜交組合的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：同亞屬二倍體與二倍體的杜鵑花種間雜交親和力強(qiáng)，坐果率為38%～100%；二倍體與多倍體以及不同亞屬之間的杜鵑花雜交不育[52]。

江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所從2005年起，利用已收集的種質(zhì)資源，進(jìn)行品種(種)間雜交育種。在十余年的雜交育種工作中，每年配置雜交組合20～50個(gè)不等，每年獲得雜交后代20 000株以上。從這些雜交后代中，每年篩選優(yōu)良單株30株以上。目前，共選育出適于江蘇地區(qū)種植的品種10個(gè)，其中9個(gè)通過(guò)省內(nèi)鑒定，分別為紫金玫鵑(蘇鑒花201001)、紫金艷后(蘇鑒花201214)、富麗金陵(蘇農(nóng)科鑒字2011第23號(hào))、馥郁金陵(201320)、江南春早(蘇鑒花201319)、蝶舞(蘇R-SC-RH-011-2015)、胭脂蜜(蘇鑒花201105)、紫金粉玉(蘇鑒花201507)、霞滿(mǎn)紫金(蘇鑒花201506)。胭脂蜜(品種權(quán)號(hào)：20160071)與蝶戀(品種權(quán)號(hào)：20160070)已經(jīng)獲得國(guó)家品種權(quán)。

3.2 分子標(biāo)記輔助育種

隨著杜鵑花育種的發(fā)展，育種的難度逐漸提高，必然會(huì)促進(jìn)育種相關(guān)的生物學(xué)研究。轉(zhuǎn)基因、分子標(biāo)記、連鎖圖譜的構(gòu)建等現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)在杜鵑花育種研究中也得到應(yīng)用。Pavingerova等應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法對(duì)幾個(gè)杜鵑花品種進(jìn)行基因?qū)?，部分個(gè)體轉(zhuǎn)移成功，但后來(lái)在營(yíng)養(yǎng)繁殖中轉(zhuǎn)移片段又丟失了[53]。德國(guó)Dunemann等利用種間雜交后代建立了杜鵑花的分子遺傳圖譜，并對(duì)有些標(biāo)記與抗堿性、葉面失綠、花色等性狀的相關(guān)性進(jìn)行了分析[54]；后來(lái)為進(jìn)一步提高杜鵑花的耐堿性，他利用QTLs分子標(biāo)記輔助選擇和轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育耐堿單株，但至今沒(méi)有篩選出耐土壤pH值7.0以上的品種[55]。

國(guó)內(nèi)有關(guān)杜鵑花分子育種研究目前還停留在前期準(zhǔn)備工作中，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所肖政等采用SRAP分子標(biāo)記分析了30個(gè)杜鵑花物種的遺傳多樣性，通過(guò)主坐標(biāo)分析(PCA)和UPGMA法構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)顯示：30份杜鵑花材料可分為5類(lèi)，其中云錦杜鵑和光枝杜鵑、井岡山杜鵑和皺葉杜鵑、迎紅杜鵑和興安杜鵑、露珠杜鵑和大果杜鵑分別聚為一組，結(jié)果與基于表型特征的分類(lèi)基本一致，表明SRAP標(biāo)記具有較準(zhǔn)確的鑒別能力，是進(jìn)行杜鵑花屬植物遺傳多樣性分析的有效分子標(biāo)記[56]。同時(shí)肖政等還采用ISSR分子標(biāo)記對(duì)25份杜鵑花種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，杜鵑花在物種水平上表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性[57]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物基因的表達(dá)研究，肖政等還通過(guò)對(duì)羊躑躅花瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的研究，挑選出了11個(gè)內(nèi)參基因，并分別對(duì)其在羊躑躅不同組織和花瓣發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明EF1-α、18S、RPL3是研究羊躑躅花發(fā)育的最佳參考基因[58]。

4 總結(jié)與展望

4.1 資源共享平臺(tái)建設(shè)

資源共享平臺(tái)的建設(shè)，可以促進(jìn)資源整合、保護(hù)、共享和利用。平臺(tái)應(yīng)建立杜鵑花標(biāo)準(zhǔn)描述規(guī)范，對(duì)各性狀進(jìn)行觀測(cè)記載及電子存檔，通過(guò)科學(xué)分類(lèi)、統(tǒng)一編目和描述規(guī)范，使得杜鵑種質(zhì)資源得到更好的利用。但實(shí)際上，資源共享從來(lái)只是紙上談兵，并不可能落到實(shí)處，究其原因還是利益在作祟，利益共享也許才能真正實(shí)現(xiàn)資源共享。

4.2 離體培養(yǎng)及保存技術(shù)研究

大多數(shù)杜鵑種質(zhì)資源可通過(guò)扦插繁殖及活體植株保存，但是野生資源的繁殖相對(duì)較難，且野生資源的適應(yīng)性受地域條件限制，作為活體植株保存容易死亡而造成重復(fù)引種困難，因此需對(duì)其離體貯存條件及生理特性進(jìn)行研究。國(guó)內(nèi)目前只對(duì)少數(shù)幾種杜鵑花野生種質(zhì)進(jìn)行了離體保存研究，大多數(shù)瀕危種質(zhì)和難繁種質(zhì)的離體保存研究還是一片空白，相關(guān)工作有待進(jìn)一步加強(qiáng)。

4.3 新品種選育工作

杜鵑花品種的適應(yīng)性有地域限制，特別是綠化用品種。我國(guó)幅員遼闊，各地地理環(huán)境和氣候條件差別巨大，大多數(shù)品種只能適應(yīng)某個(gè)區(qū)域范圍。因此，杜鵑花的育種者也應(yīng)有區(qū)域責(zé)任感和緊迫感，選育更多適應(yīng)周邊環(huán)境的品種。