王燕華,孫印石※,宮瑞澤,霍曉慧,劉暢,張磊,莊寶策
(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,長春 130118;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所,長春 130112;3.吉林省永吉縣一拉溪鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,吉林 永吉 132213)
鹿茸(Cervicornu pantotrichum)是鹿科鹿屬動物梅花鹿(Cervus nipport Temminck)或馬鹿(Cervus elaphus Linnaeus)的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]。前者稱“花鹿茸”,后者稱“馬鹿茸”。鹿茸性溫,味甘、咸,歸腎、肝經(jīng),具有壯腎陽、益精血、強筋骨、調(diào)沖任、托瘡毒的功效[1]?;谷壮蕡A柱狀分枝,具有1個分枝者習(xí)稱“二杠”,具有2個分枝者稱為“三杈”;馬鹿茸根據(jù)茸形通常分為蓮花茸、三杈茸、四杈茸等。
鹿茸的初加工是指將割取下的新鮮鹿茸或解凍鮮鹿茸經(jīng)過水煮、烘烤、風(fēng)干,或冷凍干燥、微波干燥、遠紅外干燥等方式,制作成干品鹿茸的過程。鹿茸初加工不僅影響鹿茸的外觀形態(tài)和商品價值,而且對鹿茸的化學(xué)成分或藥理活性也會產(chǎn)生一定的影響。煮炸是應(yīng)用最早且沿用至今的一種鹿茸加工工藝,主要包括水煮、烘烤、風(fēng)干3個環(huán)節(jié),3個環(huán)節(jié)循環(huán)往復(fù),直至鹿茸干燥完全,以這種工藝加工成的鹿茸通常稱為煮炸茸或水炸茸。煮炸茸可以有效消除鹿茸中可能攜帶的布氏桿菌、結(jié)核桿菌等病原微生物,使茸頭飽滿有型,茸皮光鮮亮麗。冷凍干燥的鹿茸是指應(yīng)用真空冷凍干燥技術(shù),將鮮鹿茸冷凍結(jié)冰,然后在較高真空度下通過升華作用將其中的水分除去制得的鹿茸,簡稱凍干茸。冷凍干燥加工的鹿茸茸皮褶皺,內(nèi)部組織嚴重萎縮,易出現(xiàn)不同程度的中空現(xiàn)象,難以進一步炮制成鹿茸片進行商品流通,通常是經(jīng)過消毒等處理后制作成鹿茸粉進行服用或用于有效成分提取及開發(fā)利用。
鹿茸的煮炸工藝又包括排血茸的加工與帶血茸的加工。排血茸是指將新鮮鹿茸利用離心、高壓(水壓或氣壓)或真空抽取等手段把茸血排出茸體后再進行水煮等操作加工而成的鹿茸,茸體中殘留的部分血液因受熱體積膨脹,由鋸口端進一步排出茸體。帶血茸則是采用烙鐵封鋸口等手段把茸血保留在茸體內(nèi)再進行水煮等操作加工而成的鹿茸,水煮時間相對較短,基本保留了鹿茸中的絕大部分血液。經(jīng)過排血處理,鹿茸中的淤血幾乎完全排出茸體,茸體表面呈微白或黃白色,均勻透亮,炮制成的鹿茸飲片結(jié)構(gòu)清晰,色淺,體輕,氣微腥,味微咸,這可能是某些中醫(yī)偏愛以排血茸入藥的原因。但有人認為,帶血茸中含有更為豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸等成分,并且鹿茸血本身含有多種營養(yǎng)物質(zhì),保留在茸體內(nèi)藥用價值更高。
鹿茸的炮制是指根據(jù)醫(yī)療、調(diào)劑、制劑需要,將干鹿茸加工成藥材飲片等形式,以供臨床直接應(yīng)用或制成各種劑型。藥典記載了鹿茸的2種炮制方式,即“鹿茸粉”與“鹿茸片”。取鹿茸,燎去茸毛,刮凈,劈成碎塊,研成細粉,即鹿茸粉[1]。商品鹿茸多以鹿茸片的形式流通和入藥,鹿茸片的炮制相對復(fù)雜:取鹿茸,燎去茸毛,刮凈,以布帶纏繞茸體,自鋸口面小孔灌入熱白酒,并不斷添酒,至潤透或灌酒稍蒸,橫切薄片,壓平,干燥[1]。鹿茸是目前發(fā)現(xiàn)的唯一可再生的哺乳動物器官[2~6],具有特殊的組織結(jié)構(gòu)特征,對鹿茸進行組織橫切,橫切面上自外向內(nèi)分為皮膚層、間質(zhì)層、髓質(zhì)層。根據(jù)農(nóng)業(yè)部頒布的行業(yè)標準NY/T1162-2006,可將鹿茸由尖部至基部炮制成的茸片依次分為蠟片、粉片、紗片、骨片4個部位。
徐建平等[7]采用改進的鄰苯三酚法測得煮炸茸中超氧化物歧化酶(SOD)的活性為2 400mol(/min g),顯著低于凍干茸的4 880mol(/min g)。王桂成等[8]利用Gemstar生化自動分析儀檢測了活性茸(凍干茸)和煮炸茸中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、肌酸激酶(CK)、r-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(r-GT)、乳酸脫氫酶(LDH)、膽堿酯酶(CHE)7種酶的活力,結(jié)果表明,活性茸酶活力是煮炸酶活力的 2.5倍~250倍。除了溫度條件,水煮時間也會影響成分活性。田再民等[9~11]研究了溫度和時間對鮮鹿茸中SOD、ALP、谷胱甘肽(GSH)活性的影響,分別采用鄰苯三酚自氧化法、磷酸苯二鈉法熒光分光光度法測定SOD、ALP、GSH的活性,鹿茸經(jīng)高溫處理后SOD、ALP、GSH活性均有所降低,并且高溫條件下隨著時間的延長,活性降低越明顯。因此,傳統(tǒng)煮炸工藝的水煮、烘烤等高溫條件可使得鹿茸中的酶等熱敏性成分的活性降低甚至失活。
不同的加工炮制方式也會引起鹿茸中蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸、礦質(zhì)元素等常規(guī)成分的差異??吕罹У萚12]采用Folin-酚法測定凍干鹿茸中水溶性蛋白的含量為126.54mg/g,是煮炸茸的13.1倍。林偉欣等[13]采用考馬斯亮藍顯色(Bradford)法測得凍干茸中水溶性蛋白的含量高于烘干茸。孟憲貞等[14]利用氨基酸自動分析儀、原子吸收分光光度計、流動注射分析儀測得凍干茸中氨基酸、蛋白質(zhì)、鐵、鋅、總氮及總磷的含量均高于煮炸茸,灰份低于水炸茸。侯召華等[15]比較了煮炸干燥法和真空冷凍干燥法對鹿茸中脂溶性成分及色差的影響,煮炸茸和凍干茸中分別檢測到13種和 16種脂肪酸,總脂肪酸含量分別是90.42mg/100g和277.12mg/100g,總膽固醇含量分別為266.77mg/100g和295.15mg/100g,凍干茸中總脂肪酸、總膽固醇含量均顯著高于煮炸茸。
茸體中的血液量可能會引鹿茸中化學(xué)成分的差異。汪樹理等[16]、王艷梅等[17]對帶血和排血2種不同初加工方式的花鹿茸根部骨片中游離氨基酸及水解氨基酸、總磷脂、鈣、磷等成分含量進行測定,結(jié)果顯示,排血茸骨片與帶血茸骨片差異不顯著,認為可能是由于骨片部位距離鋸口端較近,茸血存留量較少,不足以引起顯著性差異。王燕華等[18,19]對排血與帶血、煮炸與凍干的鹿茸分別進行對比研究,以粗蛋白、水解氨基酸、多糖、脂肪酸、礦質(zhì)元素、生物胺、核苷類等理化成分作為分析指標,結(jié)果表明,除粗蛋白及總氨基酸外,其它指標含量排血茸均高于帶血茸;除礦物元素外,其它指標含量凍干茸均高于煮炸茸。
不僅初加工及炮制方式對鹿茸的化學(xué)成分含量會產(chǎn)生影響,即使是同一種方式加工成的鹿茸,不同區(qū)段(部位)的化學(xué)成分含量也有所差異;另外,花鹿茸與馬鹿茸同一部位的化學(xué)成分含量也有差異?;谷字械乃苄缘鞍住⒘字?、鈣、磷等含量高于馬鹿茸,氨基酸、?;撬?、精咪等含量低于馬鹿茸。陳丹等[20,21]對花鹿茸、馬鹿茸不同部位的氨基酸、總磷脂、鈣、磷、?;撬岷窟M行分析,結(jié)果顯示,氨基酸、必需氨基酸、總磷脂、?;撬岷烤苫恐另敹酥饾u增加,鈣、磷含量則由基部至頂端逐漸減少;馬鹿茸中總磷脂及鈣、磷含量低于花鹿茸,氨基酸、牛磺酸含量高于花鹿茸。董方言等[22]采用苯甲酞衍生物法測得花鹿茸上部、中部、下部精咪的含量分別為0.353mol/g、0.004mol/g、0.001mol/g,馬鹿茸上部、中部、下部精咪的含量依次是 0.403mol/g、0.196mol/g、0.073mol/g,即上部、中部、下部依次減少;馬鹿茸中精咪含量顯著高于花鹿茸,認為精咪可作為區(qū)分馬鹿茸和花鹿茸的指標性成分。董萬超等[23]采用原子吸收光譜法和電感耦合等離子體發(fā)射光譜法從新疆塔里木馬鹿茸、東北馬鹿茸和東北梅花鹿茸不同部位中均檢測出26種無機元素,上段至下段礦物元素總量逐漸增加,說明上段至下段骨化程度逐漸增加;東北梅花鹿二杠茸礦物元素總量最低,可能是由于二杠茸收取時間早(脫盤45d左右),骨化程度低,質(zhì)地較嫩。汪樹理等[24]對廣州產(chǎn)梅花鹿茸和馬鹿茸從上、中、下各部位進行取樣分析,結(jié)果表明,鹿茸氨基酸總量從基部到頂端逐漸增加,廣州產(chǎn)馬鹿茸氨基酸含量高于廣州產(chǎn)花鹿茸,認為這可能與鹿茸的組織結(jié)構(gòu)和生長發(fā)育有關(guān),但有人認為還可能是由鹿的種屬差異、飼養(yǎng)管理等諸多因素引起的。趙磊等[25]采用原子吸收光譜法測定花鹿茸、馬鹿茸、花馬雜交鹿茸、麋鹿茸、馴鹿茸等五種鹿茸的15種無機元素,利用氨基酸分析儀結(jié)合分光光度法測定5種鹿茸不同部位的17種氨基酸,結(jié)果表明,粗蛋白、Ca、P、Na、Fe、Ba、Sr、谷氨酸及甘氨酸可作為5種鹿茸的特征成分;上、中、下部位氨基酸總量逐漸減少,馬鹿茸中的氨基酸總量高于花鹿茸。劉佳等[26]測得梅花鹿二杠茸尖部水溶性蛋白含量是30.50%,基部為6.77%;梅花鹿三杈茸尖部是29.69%,基部為5.98%;馬鹿四杈茸尖部是28.27%,基部為3.22%;水溶性蛋白的含量為梅花鹿二杠茸>梅花鹿三杈茸>馬鹿四杈茸;尖部顯著高于基部。
礦質(zhì)元素一般呈現(xiàn)由尖部至基部遞增的分布規(guī)律,但并非所有的元素均具有該特點。鹿茸中的蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類等有機成分更多地集中在中上部,灰分、鈣、磷、鎂等無機成分在鹿茸基部分布較多。王艷梅等[27~31]測得東北花鹿茸鈣、磷、鎂、水溶性蛋白、水解氨基酸、游離氨基酸、總糖、還原糖、多糖、總磷脂、?;撬岬暮吭谂D片、粉片、血片(紗片)、骨片的分布呈遞減趨勢,元素鉀、鈉的含量由蠟片至骨片逐漸增加。汪樹理等[32]分別在臘片、粉片、血片(紗片)、骨片4個部位進行取樣,結(jié)果顯示,從臘片到骨片,多糖、鉀和鈉的質(zhì)量分數(shù)逐漸降低,鈣、磷、鎂的質(zhì)量分數(shù)逐漸升高;元素鉀、鈉的分布規(guī)律與王艷梅的結(jié)論相反,這可能是由于鹿茸中礦質(zhì)元素的來源涉及水源、飼料、生長環(huán)境、收茸季節(jié)等諸多因素,也可能是由個體差異造成的。薄士儒等[33]對散養(yǎng)與圈養(yǎng)梅花鹿的鹿茸不同部位的16種氨基酸組分及15種無機元素的含量進行分析,結(jié)果顯示,圈養(yǎng)梅花鹿的鹿茸各部位必需氨基酸、游離氨基酸、無機元素的總量均高于散養(yǎng)梅花鹿;鹿茸中氨基酸總量從上至下逐漸減少,無機元素總量由上往下逐漸增多。林偉欣等[13]測得烘干梅花鹿二杠茸不同部位水溶性蛋白質(zhì)的含量變化為粉片高于蠟片,蠟片高于紗片和骨片,紗片和骨片相近。丁倩男等[34]建立了適合梅花鹿茸蛋白質(zhì)組學(xué)研究的雙向電泳方法,并采用該方法比較不同部位花鹿茸的蛋白圖譜差異,測得不同部位花鹿茸可溶性蛋白的含量相差很大,上部是下部的4.76倍。LiF等[35]采用UPLC-MS/MS測定了花鹿茸不同部位的17種核苷和堿基,結(jié)果顯示,核苷和堿基的總量由尖部至基部呈遞減趨勢。
郝林琳等[36,37]用醋酸溶液和乙醇對鮮馬鹿二杠茸的主干頂部、中部、根部3個部位的多肽進行提取分析,測得多肽及胰島素生長因子IGF-1的含量均呈現(xiàn)由頂部至根部逐漸減少的趨勢。王淑娟等[38]對同一個馬鹿茸的上段、中段和下段中的錳、銅、鋅、鈷、鎳、錳、鈣等7種微量元素的含量進行測定,結(jié)果表明,馬鹿茸中的鋅元素由上至下逐漸減少,鐵元素由上至下逐漸增多。SunwooHH等[39]從馬鹿茸尖部、上部、中部、下部進行糖胺聚糖的分離,得到含有少量透明質(zhì)酸的硫酸軟骨素,測得硫酸軟骨素的含量分別是5.9g/mg、6.5g/mg、0.9g/mg、0.6g/mg。JeonB 等[40]測得花鹿茸尖部膠原蛋白的含量顯著高于中部、基部,尖部、中部、基部逐漸降低,并推測隨著鹿茸生長期的延長,鹿茸品質(zhì)可能會有所降低。LGu等[41]對赤鹿茸中的IGF-1mRNA和IGF-I肽進行定位,原位雜交和免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,IGF-I在鹿茸頂端、軟骨細胞及成骨細胞中均有表達,但是IGF-1僅在中部和基部骨周圍的成骨細胞中檢測到;免疫印跡分析證明,在鹿茸的尖、上、中、下4個部位,IGF-1的表達存在顯著性差異。Landete-CastillejosT等[42]通過測定25只1歲赤鹿的鹿茸尖部和基部灰分、鈣、磷、鉀、鈉、鎂、鐵、鋅的含量發(fā)現(xiàn),鹿茸尖部和基部灰分、鈣、磷、鉀、鋅、鐵含量有差異顯著,鈉、鎂含量差異不顯著。JeonBT等[43]將鹿茸分為尖部、上部、中部、下部、基部5個部位,測得粗蛋白和乙醚浸出物含量尖部最高,灰分含量基部最高,膠原蛋白含量由尖部到基部逐漸增加;尖部天冬氨酸、谷氨酸、異亮氨酸含量較高。
現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,鹿茸具有防治骨質(zhì)疏松[44~50]、促進細胞增殖[51]、修復(fù)肝損傷[52]、抗疲勞[53~57]、抗氧化[57~59]、抗炎[58~61]等藥理活性。高溫處理可能會影響鹿茸的藥理活性。鄭洪新等[62]將現(xiàn)代凍干方法加工的活性鹿茸與傳統(tǒng)加工工藝的熱炸茸防治骨質(zhì)疏松癥的作用效果進行比較研究,凍干活性茸對骨質(zhì)疏松癥模型大鼠的治療效果更佳。李召等[63]研究冷、熱兩種工藝加工的鹿茸提取物對慢性再生障礙性貧血患者骨髓造血細胞體外增殖的效用發(fā)現(xiàn),冷工藝茸具有更強的生物學(xué)效應(yīng)。
潘風(fēng)光等[64]應(yīng)用分子排阻層析和離子交換層析提取不同加工方法制得的花鹿茸中活性多肽(PAP)的差異,通過淋巴細胞增殖、細胞因子產(chǎn)生等試驗,檢測花鹿茸PAP對淋巴細胞的免疫功效,結(jié)果顯示,煮炸茸、冷凍鮮茸、凍干茸中活性多肽蛋白的含量分別為 1.10mg/mL、1.30mg/mL、9.20mg/mL;花鹿茸活性多肽對機體的細胞免疫有顯著增強作用。柯李晶等[12]測得凍干花鹿茸水提物促大鼠成骨樣細胞增殖的活性分別是煮炸茸和冷凍鮮茸的2.19倍和1.89倍,抑制肝癌細胞的活性分別是煮炸茸和冷凍鮮茸的1.40倍和1.59倍。靳夢亞等[65]利用同位素相對標記與絕對定量(iTRAQ)技術(shù)結(jié)合雙向液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(2D-LC-MS/MS)法對花鹿茸鮮品、煮炸、直接凍干、勻漿、凍干加保護劑、凍干未加保護劑等不同處理的鹿茸樣品進行差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究,認為煮炸工藝經(jīng)過加熱及去血處理,參與結(jié)合功能的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生變化;凍干加保護劑(海藻糖)工藝可有效保護、優(yōu)化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能。
洪勇等[66]采用酸性緩沖液浸提等方法制得馬鹿茸干、鮮品多肽,以Folin-酚比色法測定其含量,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測其細胞增殖效果,結(jié)果馬鹿茸鮮品多肽主要由相對分子質(zhì)量(Mr)為 14 400、9 500、6 500 和 4 100 的多肽組成,干品多肽Mr在14 400、4 100~6 500的多肽含量較低,鮮品多肽促進細胞增殖作用顯著高于干品多肽。
鹿茸促進細胞增殖分化的活性由尖部至基部逐漸降低。吳帆等[67]以大鼠腎成纖維細胞NRK-49F作為模型,以MTT法檢測鮮品花鹿茸上、中、下3個部位水提液的促細胞增殖率,上、中、下部鹿茸樣品可溶性蛋白含量分別為17.89mg/mL、16.04mg/mL、6.89mg/mL,3個部位對NRK-49F的最大促增殖率分別為66.76%、64.36%、58.87%。丁倩男等[68]考察了傳統(tǒng)煮炸工藝對花鹿茸不同部位細胞增殖活性的影響,花鹿鮮鹿茸上、中、下部均具有促進細胞增殖的能力,從上到下活性減弱,煮炸茸的促細胞增殖能力明顯降低。曲雷鳴等[69]研究了梅花鹿二杠茸蠟片、二茬梅花鹿二杠茸蠟片、梅花鹿三杈茸蠟片、梅花鹿二杠茸白片、梅花鹿二杠茸血片、馬鹿蓮花茸蠟片、馬鹿單門樁茸血片、馬鹿三杈茸白片等8種不同規(guī)格鹿茸含藥血清對骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)細胞增殖及成骨分化的影響,結(jié)果顯示,8種規(guī)格的鹿茸含藥血清均可促進體外培養(yǎng)BMSCs的增殖,對BMSCs成骨分化過程中ALP、BGP、BMP-2蛋白的分泌也均有促進作用;在上述鹿茸的蠟片促進BMSCs增殖及成骨分化的能力最強。田敬歡等[70]研究了鮮品花鹿茸上、中、下部對PC12細胞的促增殖和誘導(dǎo)分化作用,3個部位對細胞增殖均有促進作用,且與濃度呈正相關(guān);當濃度為800mg/mL時,上、中、下部對細胞的分化率分別為91.38%、80.29%、76.52%。
鹿茸不同部位的抗骨質(zhì)疏松、抗疲勞等作用也有一定的差異,相比下半段,鹿茸上半段具有更高的活性。TsengSH等[71]用去卵巢大鼠對花鹿茸不同部位的化學(xué)成分及抗骨質(zhì)疏松作用進行評價,結(jié)果顯示,鹿茸尖部的水溶性浸出物、乙醇提取液、氨基酸、睪酮、胰島素樣生長因子(IGF-1)、睪酮、雌二醇等成分的含量顯著高于基部,中部睪酮、IGF-1的含量也明顯高于基部,元素鈣的含量從尖端向下逐漸增加;尖部和中部比基部具有更好的骨保護作用。馮漢鴿等[72]把鹿茸尖部、中部、下部分別加水煎煮制成10%的鹿茸煎液,并進行抗疲勞、耐缺氧等對比實驗發(fā)現(xiàn),鹿茸尖部抗疲勞及耐缺氧等強壯作用明顯,中部、下部效果不明顯。高暢等[73]取梅花鹿鹿茸蠟片、粉片、血片,以75%乙醇提取,冷凍干燥得鹿茸各部位的醇提物,研究鹿茸各部位醇提物對離體脂肪組織的分解作用,結(jié)果表明,蠟片促進離體脂肪分解作用最強,粉片次之,血片最弱;蠟片、粉片、血片中次黃嘌呤的含量分別為 0.386mg/g,0.268mg/g,0.162mg/g,認為次黃嘌呤可能是促進脂肪分解的主要活性因子。
劉華淼等[74]以臘片部位、血片部位和骨片部位的花鹿茸組織為試驗材料,運用雙向電泳(2-DE)和MALDI-TOF-TOF串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對不同部位花鹿茸差異表達蛋白質(zhì)進行鑒定,篩選出37個差異表達蛋白,臘片、血片(紗片)、骨片組織中分別有18、5、14個蛋白質(zhì)表達上調(diào);轉(zhuǎn)錄延伸因子EFB1在蠟片部位表達量顯著上調(diào),是骨片部位的11倍、血片部位的3倍;載脂蛋白A1(APOA1)的表達量是蠟片部位的20倍,推測鹿茸可能以脂蛋白介導(dǎo)的骨礦化機制進行骨化。
冷凍干燥技術(shù)能夠有效縮短鹿茸的加工周期,較好地保留鹿茸中的多糖、多肽、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸、生物胺、核苷類等熱敏性物質(zhì)。但是鹿茸的傳統(tǒng)煮炸工藝不僅僅是一種干燥方式,還是殺菌消毒、保形護色、增強藥物療效、改變藥物性能的一種炮制方法。排血茸與帶血茸的選擇與個人喜好、用藥習(xí)慣、地域等因素有關(guān)。我國南方部分中醫(yī)偏愛以排血茸入藥,認為“越白越好”,韓國的中醫(yī)則喜歡用帶血加工的鹿茸。排血茸在我國南方地區(qū),尤其是江西、湖南等地,具有良好的銷售市場,帶血茸則主要流通于東北地區(qū)及銷往韓國、日本等東亞地區(qū)。鹿茸加工方式的選擇應(yīng)以現(xiàn)有的加工條件及成本為基礎(chǔ),以更為充分有效的利用率為方向,綜合考慮化學(xué)成分、藥理作用、商業(yè)用途、用藥習(xí)慣、地域差異等因素,對鹿茸進行更為合理地開發(fā)與利用。