魏藝聰+蔣超+袁媛+趙玉洋+金艷+黃璐琦

[摘要] 為了建立梅花鹿、馬鹿及其雜交鹿茸的特異性PCR鑒別方法。采集不同來(lái)源的梅花鹿、馬鹿鹿及其雜交鹿的鹿角或鹿茸樣品共48份，其中24份為市場(chǎng)流通的待測(cè)樣品。分別利用COI與SRY基因序列作為其父母本的鑒別標(biāo)記，對(duì)已知樣品的COI與SRY基因進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，進(jìn)行同源比對(duì)后根據(jù)其變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異鑒別引物，分別基于COI與SRY基因建立對(duì)梅花鹿、馬鹿及其雜交鹿的鹿茸的特異PCR鑒定方法，并隨機(jī)對(duì)市場(chǎng)流通的24份待測(cè)鹿茸樣品進(jìn)行鑒別分析。該實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建雙位點(diǎn)特異PCR體系，基于COI的鑒別位點(diǎn)，可通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得232 bp的梅花鹿特異片段，而產(chǎn)生518 bp的馬鹿特異片段；而基于SRY的鑒別位點(diǎn)，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得803 bp的梅花鹿特異片段，而產(chǎn)生425 bp的馬鹿特異片段。隨機(jī)抽取市場(chǎng)流通中的24個(gè)待測(cè)鹿茸樣品，經(jīng)鑒定有3個(gè)樣品屬于馬·花雜交的鹿茸樣品。該實(shí)驗(yàn)建立對(duì)梅花鹿、馬鹿及其雜交鹿的鹿茸的PCR鑒別方法簡(jiǎn)便、可靠。

[關(guān)鍵詞] 梅花鹿； 馬鹿； 雜交； 雙位點(diǎn)特異PCR體系； COI； SRY

[Abstract] For rapid identification of Cervus nippon， C. elaphus and their hybridize samples， the specific PCR for mutual authentication of them was established based on the SNPs in COI and SRY sequence. C. nippon， C. elaphus and their hybridize samples were collected from different origins， total DNA of 24 identified samples were extracted， and the COI and SRY gene was seqenced. SNPs in the COI and SRY sequences of the samples were found by Clustul X 2.1 program. Primers for identifying C. nippon and C. elaphus were designed according to the SNP site， two multi-PCR reaction system were established to identify them. In addition， 24 samples which were randomly collected in different herbal medicine market were identified. The band special for C. nippon （232 bp）and band special for C. elaphus （518 bp） based on COI sequence，and the band special for C. nippon （803 bp）and band special for C. elaphus （425 bp） based on SRY sequence， were found using multi-PCR reaction， and three of the twenty-four samples were identified as the hybridize samples. The multi-PCR reaction system could be used to identify C. nippon， C. elaphus and their hybridize samples .

[Key words] Cervus nippon； Cervus elaphus； hybridize； multi-PCR reaction system； COI； SRY

鹿茸是我國(guó)傳統(tǒng)名藥之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、強(qiáng)壯身體、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等功能[1-4]。《中國(guó)藥典》規(guī)定鹿茸基原為鹿科動(dòng)物梅花鹿Cervus nippon Temminck 或馬鹿C.elaphus Linnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，作為名貴中藥材品種，鹿茸在市場(chǎng)上供不應(yīng)求且價(jià)格昂貴。

雜交有利于提高畜牧產(chǎn)量，我國(guó)的茸鹿種間和亞種間的雜種優(yōu)勢(shì)利用一直處于國(guó)際領(lǐng)先水平，早在1958年吉林省吉林市龍?zhí)渡铰箞?chǎng)即用本交的方法開(kāi)展家養(yǎng)馬鹿（♀）與梅花鹿（♂）雜交（簡(jiǎn)稱馬·花雜交）試驗(yàn)研究，隨后茸鹿的雜交育種技術(shù)得到推廣與應(yīng)用。其中，馬·花雜交被認(rèn)為經(jīng)濟(jì)性狀最佳雜交組合之一[5-6]。導(dǎo)致中藥市場(chǎng)中除了出現(xiàn)馴鹿、白唇鹿、水鹿等常見(jiàn)動(dòng)物的茸片等混偽品，還常出現(xiàn)馬·花雜交鹿茸或花·馬雜交鹿茸。而這些鹿茸品質(zhì)特征并不一致，如趙磊等對(duì)梅花鹿茸、馬鹿茸、花馬雜交鹿茸等5種鹿茸的常規(guī)成分、無(wú)機(jī)元素和氨基酸含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明梅花鹿茸與花馬雜交鹿茸無(wú)機(jī)元素等營(yíng)養(yǎng)成分存在差異[7]。另一方面，也缺乏準(zhǔn)確可靠的雜交鹿茸鑒別方法，依據(jù)外部形態(tài)、顯微特征、理化性狀的傳統(tǒng)鑒定方法對(duì)馬鹿與梅花鹿的雜交鹿茸鑒定存在很大困難。因此，對(duì)鹿茸藥材進(jìn)行正本清源，特別是對(duì)雜交鹿茸的鑒別，對(duì)保障藥材質(zhì)量具有重要的意義。

分子標(biāo)記方法具有靈敏性高、準(zhǔn)確性好、客觀性較強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，目前在鹿茸等貴重藥材及其原動(dòng)物的分子鑒定方面有不少文獻(xiàn)報(bào)道，比如基于COI或Cyt b片段的鹿茸類藥材分子鑒定的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]。而以COI基因是線粒體DNA，屬于細(xì)胞質(zhì)遺傳，只能作為鑒別其母本的證據(jù)，因此，為了建立對(duì)雜交鹿的分子鑒別，還需要Y染色體的上基因作為父本的鑒別標(biāo)記，其中，Y染色體上的SRY基因作為哺乳動(dòng)物的性別決定基因，在不同物種間SRY基因的位置、大小、結(jié)構(gòu)等均不相同[10]。因此，SRY基因在分子進(jìn)化領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[11]。本實(shí)驗(yàn)擬利用COI和SRY基因建立梅花鹿、馬鹿及其雜交鹿的鹿茸樣本的分子鑒別方法。endprint

1 材料

1.1 儀器 微量分光光度計(jì)（Nanodrop 2000，Thermo Scientific 公司）； Veriti PCR儀 （Applied Biosystems），5810R 型低溫冷凍離心（ Eppendorf公司），ND-100型核酸蛋白分析儀（Gene 公司），DDZ-11型電池式電動(dòng)骨鉆（上海醫(yī)療器械集團(tuán)） 。

1.2 試劑及樣品 TIANDZ柱式骨骼DNAout購(gòu)自北京天恩澤公司；DL 2 000 plus DNA Marker購(gòu)自Takara 公司；多重PCR 5×Master Mix購(gòu)自NEB公司，F(xiàn)astTaq DNA聚合酶購(gòu)自TransGen公司。三氯甲烷購(gòu)自北京化工廠，均為國(guó)產(chǎn)分析純。鹿茸藥材包括馬鹿、梅花鹿及其混偽品，共計(jì)48個(gè)樣品，分別購(gòu)自新疆、吉林、安徽、湖南、重慶、廣西、云南、北京、廣州等地，樣品由金艷鑒定，藥材標(biāo)本保存于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，見(jiàn)表1。

2 方法

2.1 基因組DNA的提取和純化 取藥材樣品，經(jīng)過(guò)75%乙醇表面消毒后，利用骨鉆鉆取20 mg 樣品粉末，飲片則直接粉碎，采用TIANDZ 柱式骨骼DNAout 提取鹿茸總DNA，作為模板用于鹿茸DNA鑒別研究。

2.2 通用引物擴(kuò)增COI與SRY基因序列 應(yīng)用通用引物CO-F與CO-R擴(kuò)增COI基因序列，PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，5 min；95 ℃，30 s，45 ℃，1.5 min，72 ℃，1.5 min，5個(gè)循環(huán)；95 ℃，1 min，50 ℃，1.5 min，72 ℃，1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃，7 min。獲得PCR產(chǎn)物通過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，并用EB染色觀察，由生工（上海）有限公司測(cè)序。

應(yīng)用通用引物SR-F與SR-R擴(kuò)增SRY基因序列，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性23 min后，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸7 min。獲得PCR產(chǎn)物通過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，并用EB染色觀察，由生工 （上海） 有限公司測(cè)序。

2.3 鑒別標(biāo)記獲得與引物設(shè)計(jì) 根據(jù)測(cè)序所獲得的受試樣品的COI，SRY基因序列，并從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載梅花鹿、馬鹿、馴鹿、水鹿等物種的COI，SRY基因序列，利用ClustulX 2.1軟件進(jìn)行同源對(duì)齊，校對(duì)后分析其特異性SNP位點(diǎn)，并從特異性SNP 位點(diǎn)中篩選合適的鑒別位點(diǎn)，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)出梅花鹿、馬鹿的特異性鑒別引物。以梅花鹿COI序列JF700150.1 為參照，選擇COI序列第391位的梅花鹿特異性SNP位點(diǎn)C作為鑒別位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異識(shí)別梅花鹿的引物CCnF；而以第106位的馬鹿特異性SNP位點(diǎn)C作為鑒別位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異識(shí)別馬鹿的引物CCeF；并設(shè)計(jì)共同的反向引物CCR。梅花鹿SRY序列AB915321.1為參照，選擇SRY序列第69位的梅花鹿特異性SNP位點(diǎn)C作為鑒別位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異識(shí)別梅花鹿的引物SCnF；而以第446位的馬鹿特異性SNP位點(diǎn)G作為鑒別位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異識(shí)別馬鹿的引物SCeF；并設(shè)計(jì)共同的反向引物SCR。設(shè)計(jì)的特異性鑒別引物序列見(jiàn)表2，由生工（上海）有限公司合成。

2.4 雙位點(diǎn)特異 PCR擴(kuò)增及電泳 分別基于COI與SRY基因序列，利用梅花鹿及馬鹿的特異鑒別引物與通用反向引物分別構(gòu)建1個(gè)雙位點(diǎn)特異PCR體系：總體積20 μL，其中包括Taq DNA聚合酶1 U，5×Master Mix 4 μL，2 μmoL·L-1特異鑒別引物各1 μL，2 μmoL·L-1共同反向引物2 μL，滅菌蒸餾水補(bǔ)足20 μL。通過(guò)設(shè)置退火溫度梯度（52，54，56，58，60 ℃）考察不同退火溫度對(duì)雙位點(diǎn)特異PCR擴(kuò)增穩(wěn)定性的影響。利用所構(gòu)建的雙位點(diǎn)特異PCR體系，選擇最合適退火溫度對(duì)候選樣品進(jìn)行雙位點(diǎn)特異PCR擴(kuò)增檢測(cè)，循環(huán)數(shù)設(shè)置35個(gè)循環(huán)。待PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)體系加6 μL 6×loading buffer，混勻，取混合產(chǎn)物8 μL 點(diǎn)樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上，于200 V電壓的條件下電泳8～10 min，經(jīng)EB顯色，最后于凝膠成像儀觀察記錄結(jié)果。

3 結(jié)果分析

3.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)測(cè)序結(jié)果及從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載梅花鹿、馬鹿、馴鹿、水鹿等物種的COI，SRY基因序列，分析梅花鹿、馬鹿的特異性SNP位點(diǎn)，并從特異性SNP 位點(diǎn)中篩選合適的鑒別位點(diǎn)，以梅花鹿COI序列JF700150.1 為參照，選擇COI序列第391 位的梅花鹿特異性SNP位點(diǎn)C作為鑒別位點(diǎn)，為提高鑒別能力，把第389位點(diǎn)的堿基由A替換為T，設(shè)計(jì)特異識(shí)別梅花鹿的引物CCnF；而以第106位的馬鹿特異性SNP 位點(diǎn)C作為鑒別位點(diǎn)，并把第104位點(diǎn)的堿基由G替換為C，設(shè)計(jì)特異識(shí)別馬鹿的引物CCeF；并設(shè)計(jì)共同的反向引物CCR，則可通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得232 bp的梅花鹿特異片段，而產(chǎn)生518 bp的馬鹿特異片段。以梅花鹿SRY序列AB915321.1為參照，選擇SRY序列第69位的梅花鹿特異性SNP位點(diǎn)C作為鑒別位點(diǎn)，而把第67位點(diǎn)的堿基由T替換為A，設(shè)計(jì)特異識(shí)別梅花鹿的引物SCnF；而以第446位的馬鹿特異性SNP位點(diǎn)G作為鑒別位點(diǎn)，而把第444位點(diǎn)的堿基由T替換為A，設(shè)計(jì)特異識(shí)別馬鹿的引物SCeF；并設(shè)計(jì)共同的反向引物SCR。則可通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得803 bp的梅花鹿特異片段，而產(chǎn)生425 bp的馬鹿特異片段，見(jiàn)圖1和表2。

3.2 建立雙位點(diǎn)特異PCR鑒別受試梅花鹿、馬鹿與其雜交鹿樣品 基于基因序列，利用梅花鹿特異鑒別引物CCnF及馬鹿特異鑒別引物CCeF與通用反向引物CCR構(gòu)建1個(gè)雙位點(diǎn)特異PCR體系，另 外，基于SRY基因序列，利用梅花鹿特異鑒別引物SCnF及馬鹿特異鑒別引物SCeF與通用反向引物SCR構(gòu)建另一個(gè)雙位點(diǎn)特異PCR體系，通過(guò)退火溫度梯度實(shí)驗(yàn)，分析退火溫度對(duì)PCR反應(yīng)效率的影響，結(jié)果顯示，這2個(gè)反應(yīng)體系在退火溫度52～60 ℃條件下均能擴(kuò)增出梅花鹿與馬鹿相應(yīng)的特異鑒別條帶。endprint

選擇退火溫度56 ℃，使用以上建立的反應(yīng)體系，分別對(duì)不同來(lái)源的梅花鹿、馬鹿與其雜交鹿的鹿角樣品進(jìn)行鑒別，受試8個(gè)梅花鹿鹿角樣品，7個(gè)馬鹿鹿角樣品及5個(gè)馬·花雜交的鹿角樣品分別檢測(cè)到相應(yīng)的陽(yáng)性特異性條帶，而馴鹿與水鹿等陰性樣品則擴(kuò)增不到條帶。表明該體系具有特異性，可以直接鑒別梅花鹿、馬鹿與其雜交鹿的鹿茸樣，見(jiàn)圖2。

3.3 對(duì)市場(chǎng)流通的待測(cè)鹿茸樣品進(jìn)行鑒別分析 利用以上建立的雙位點(diǎn)特異PCR體系，對(duì)重流通市場(chǎng)中收集的8批待測(cè)的梅花鹿鹿茸樣品、16批待測(cè)的馬鹿鹿茸樣品進(jìn)行鑒別，結(jié)果顯示受試8個(gè)待測(cè)的梅花鹿鹿茸樣品的COI，SRY基因序列均屬于梅花鹿，表明其父母本均為梅花鹿。而16個(gè)待測(cè)的馬鹿鹿茸樣品的COI基因序列均屬于馬鹿，而其中有3個(gè)樣品的SRY基因序列并不屬于馬鹿，而屬于梅花鹿，表明其父本為梅花鹿，即為馬·花雜交的鹿茸樣品（見(jiàn)星號(hào)標(biāo)注），見(jiàn)圖3。

4 討論

雜交育種是選育新品種主要途徑，是育種工作最重要的方法，農(nóng)林雜交育種主要以經(jīng)濟(jì)效益為導(dǎo)向，育種目標(biāo)包括提高抗逆，產(chǎn)量，品質(zhì)等。對(duì)于藥用動(dòng)植物，育種目標(biāo)既要提高入藥部位的生物產(chǎn)量，更要提高藥用成分的相對(duì)含量。其中，對(duì)于鹿茸的生產(chǎn)，我國(guó)早在1958年就把雜交育種技術(shù)應(yīng)用于鹿茸的生產(chǎn)，并經(jīng)1987—1992年大規(guī)模推廣應(yīng)用，大幅度提高養(yǎng)鹿業(yè)生產(chǎn)力和經(jīng)濟(jì)效益[5-6，12] 。而對(duì)于中藥，雜交育種還要考慮對(duì)中藥藥性的影響。因此，如何鑒別雜交基原的中藥材是中藥分子鑒定領(lǐng)域重要關(guān)注點(diǎn)。目前，對(duì)雜交鹿茸藥性藥效是否與親本一致仍無(wú)完善評(píng)價(jià)方法，且缺乏準(zhǔn)確區(qū)分雜交與非雜交品的方法。本研究對(duì)市場(chǎng)流通的鹿茸樣品隨機(jī)選樣進(jìn)行鑒別分析，在24個(gè)馬鹿鹿茸的待測(cè)樣品就發(fā)現(xiàn)有3個(gè)是馬·花雜交鹿茸，可見(jiàn)市場(chǎng)流通的雜交鹿茸比例較高。據(jù)報(bào)道[5]，馬·花雜交F1生長(zhǎng)速度顯著高于花·馬雜交F1，呈母本顯性遺傳，成年時(shí)體重和體型與母本鹿（馬鹿）的相近，且茸生長(zhǎng)快，其生長(zhǎng)天數(shù)短，而茸質(zhì)嫩，再生茸大、嫩又成型。而其茸型和肉質(zhì)又多能呈父本顯性遺傳，不僅是最佳的茸肉兼用型鹿，還是茸血兼用鹿，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益，這可能是市場(chǎng)流通中的具有較高比例的馬·花雜交鹿茸的原因。而馬·花雜交鹿茸的藥用價(jià)值還有待進(jìn)一步研究分析。

目前以線粒體序列建立的鹿茸分子鑒別方法，只能作為鑒別其母本的證據(jù)，對(duì)雜交鹿無(wú)法進(jìn)行直接鑒別，為了建立雜交鹿茸的分子鑒別方法，本研究利用Y染色體的SRY基因作為父本的鑒別標(biāo)記。目前，SRY基因在分子進(jìn)化領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，如蔡欣等利用SRY基因多態(tài)性對(duì)牦牛與其他家牛屬動(dòng)物及其父系進(jìn)化關(guān)系分析[11]；周盼伊等利用SRY基因進(jìn)行家養(yǎng)梅花鹿品種Y染色體遺傳多樣性和父系遺傳結(jié)構(gòu)分析[13]；蘇瑩等利用Y染色體SRY基因?qū)︸R鹿的遺傳多樣性進(jìn)行研究[14]，以上研究均表明SRY基因多態(tài)性可進(jìn)行哺乳動(dòng)物父本的溯源分析。因此，本研究選擇SRY作為雜交鹿的父本鑒定標(biāo)記，結(jié)合母本標(biāo)記基因COI，可有效進(jìn)行雜交鹿的父母本鑒定。

本研究分別基于COI與SRY基因序列建立了2個(gè)雙位點(diǎn)特異PCR體系，用于鑒別鹿茸樣品的父母本來(lái)源，初步建立了雜交鹿茸的鑒定方法。本研究過(guò)程中，試圖把2個(gè)雙位點(diǎn)特異PCR體系優(yōu)化成1個(gè)多重PCR體系，發(fā)現(xiàn)在同一PCR系統(tǒng)中，基于SRY基因的鑒別引物擴(kuò)增效率很低，且不穩(wěn)定，推測(cè)是同一樣品中基因組DNA拷貝數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于線粒體DNA的拷貝數(shù)，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增時(shí)擴(kuò)增效率顯著低于基于COI的鑒別引物。后續(xù)可通過(guò)降落PCR方法等進(jìn)一步優(yōu)化，構(gòu)建有效穩(wěn)定單一的多重PCR鑒別方法，可更簡(jiǎn)便進(jìn)行雜交鹿茸的分子鑒定。本研究結(jié)果對(duì)雜交鹿茸鑒別也具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，也為后續(xù)進(jìn)行雜交鹿茸的品質(zhì)評(píng)價(jià)時(shí)提供有效的鑒別方法。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]endprint