肖林焱+王海麗+陳毅+張麗+程芳芳+單鳴秋+丁安偉

[摘要] 采用氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs） 損傷模型，MTT 比色法測(cè)定細(xì)胞活力，評(píng)價(jià)茜草炭不同極性部位提取物的抗氧化損傷活性，同時(shí)采用超高效液相色譜與串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-TOF-MS） 對(duì)各極性部位化學(xué)成分進(jìn)行定性研究。結(jié)果顯示，乙酸乙酯部位與正丁醇部位均可顯著提高細(xì)胞活力（P<0.01），石油醚部位對(duì)細(xì)胞活力影響不大，水提取部位對(duì)損傷的HUVECs有一定的抑制作用。UPLC-Q-TOF-MS分析結(jié)果顯示，從茜草炭4個(gè)極性部位提取物中共鑒定化合物32種，包括31種醌類及其糖苷類和1個(gè)烯萜（茜草哌唑嗪C），石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水提取部位分別鑒定出化合物23，32，26，15種。關(guān)聯(lián)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙酸乙酯部位和正丁醇部位為茜草炭抑制ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs損傷的有效部位，為闡明茜草炭的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)，為茜草炭功效-物質(zhì)相關(guān)性研究奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 茜草炭； 極性部位； 化學(xué)成分定性； 細(xì)胞損傷； ox-LDL

[Abstract] The protective effect of different polar fractions of Carbonized Rubiae Radix et Rhizoma （cRRR） against ox-LDL-induced damage to human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） was investigated by MTT assay， and the components were identified by using UPLC-Q-TOF-MS. According to the study， ethyl acetate extract and n-butanol extract could increase cell viability （P<0.01）， while petroleum ether extract had no influence， and water extract could even inhibit the cell viability to some degree. Moreover， 32 compounds in four polar fractions were analyzed， including 31 quinones and their glycosides， and one rubiprasins C. Petroleum ether extract， ethyl acetate extract， n-butanol extract and water extract contained 23， 32， 26， 15 compounds， respectively. According to cell experiments in vitro， active fractions were ethyl acetate extract and n-butanol extract. The results could provide scientific references for further studies on effective material basic of cRRR， and lay a foundation for studies on the relationship between efficacies and materials.

[Key words] Carbonized Rubiae Radix et Rhizoma （cRRR）； polar fraction； compound identification； cell injury； ox-LDL

茜草炭是由茜草科茜草屬植物茜草Rubia cordifolia L. 的干燥根和根莖經(jīng)炒炭炮制而成[1]，茜草具有涼血化瘀止血、活血通經(jīng)的功效，炒炭后寒性減弱，澀性增加，止血作用增強(qiáng)，具有“化瘀”、“止血”雙向調(diào)節(jié)作用，臨床上主要用于治療由瘀血阻滯引起的吐血、崩漏、外傷出血等出血癥[2]。

本課題組前期從血液流變學(xué)、血小板功能、凝血4項(xiàng)以及纖溶系統(tǒng)的影響等多方位考察了茜草炭不同提取方式提取物對(duì)急性血瘀模型大鼠和子宮出血模型大鼠的化瘀止血功效[3-4]，但其功效成分仍有待進(jìn)一步研究。文獻(xiàn)研究表明，茜草炭，血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及功能障礙是多種出血證的起始因素，內(nèi)皮細(xì)胞受多種因素刺激致?lián)p傷后，會(huì)引發(fā)一系列氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)[5]，對(duì)損傷內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用可以有助于揭示中藥活性組分的止血作用與機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)采用ox-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，比較不同極性部位提取物對(duì)損傷內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響，同時(shí)結(jié)合UPLC-Q-TOF-MS對(duì)各極性部位化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，以期為闡明茜草炭活性部位化瘀止血的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供一定依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與試劑

Triple TOFTM5600型超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜，電噴霧離子源（ESI），Analyst1.6 色譜工作站，PeakView質(zhì)譜分析軟件（美國(guó)AB公司）；KH-500B超聲機(jī)（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；Hangping FA1104N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司，d=0.1 mg）；MS105DU型電子分析天平（梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司，d=0.01 mg）；Milli-QDirect 8 超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。SWCJ-IF型雙人雙面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）、恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo公司）、全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）。endprint

甲醇（質(zhì)譜純，美國(guó)MERCK公司）；甲醇（色譜純，江蘇漢邦科技發(fā)展有限公司）；甲酸（質(zhì)譜純，美國(guó)MERCK公司）；超純水（Milli-Q Direct 8超純水）。DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco公司）、胎牛血清（Gibco公司）、0.25%胰蛋白酶（Gibco公司）、生物學(xué)DMSO（Sigma公司）、PBS（Hyclone公司）、MTT（Solarbia公司）。

1.2 藥品

茜草購(gòu)自安徽豐原銅陵中藥飲片有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定為茜草科植物茜草R. cordifolia的干燥根和根莖。茜草炭按2015年版《中國(guó)藥典》一部有關(guān)要求炒制而成。

茜草素、甲基異茜草素、1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌、1-羥基-2-甲基蒽醌均為自制，經(jīng)HPLC檢測(cè)純度≥98%，羥基茜草素（南京森貝伽生物科技有限公司，純度≥98%），大葉茜草素（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110884-200604，純度≥98%）。氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）（廣州奕源生物科技有限公司，批號(hào) YB-002-1）。

1.3 細(xì)胞株

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（ human umbilical vein endothelial cells，HUVECs） 購(gòu)于上海拜力生物公司。

2 方法

2.1 供試品與對(duì)照品溶液的制備

2.1.1 茜草炭不同極性部位制備 取茜草炭1 630 g，采用先醇提后水提的復(fù)合提取法[3]，得茜草炭復(fù)合物312.6 g，而后采用系統(tǒng)溶劑提取法依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水對(duì)其進(jìn)行提取，真空減壓干燥，分別得石油醚部位浸膏16.3 g（得率1.00%）、乙酸乙酯部位浸膏28.1 g（得率1.72%）、正丁醇部位浸膏34.1 g（得率2.09%）、水部位浸膏213.3 g（得率13.09%）。

2.1.2 供試品溶液的制備 分別稱取茜草炭石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水提取部位浸膏適量（分別相當(dāng)于生藥量1 g），置10 mL量瓶中，加80%甲醇超聲至溶解后稀釋至刻度。13 000 r·min-1離心10 min，取上清，即得。

2.1.3 對(duì)照品溶液的制備 分別取大葉茜草素、羥基茜草素、茜草素、甲基異茜草素、1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌、1-羥基-2-甲基蒽醌適量，置5 mL量瓶中，80%甲醇溶解制成對(duì)照品溶液。再分別取各對(duì)照品溶液0.8 mL，置5 mL量瓶中，加80%甲醇制成各成分質(zhì)量濃度分別為25 mg·L-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2 LC-Q-TOF-MS定性分析

2.2.1 色譜條件 Acquity BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），以0.3%甲酸溶液（A）-甲醇（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～1 min，90% A；1～4 min，90%～65% A；4～9 min，65%～40%A；9～15 min，40%～30%A；15～20 min，30%～10%A；20～22 min，10%～90%A；22～24 min，90%A），柱溫30 ℃，流速0.2 mL·min-1，進(jìn)樣量2 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源（ESI），掃描范圍m/z 50～1 500，正負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)。離子源溫度550 ℃；離子噴霧電壓5 500 V；霧化氣（Gas1）55 psi（1 psi=6.895 kPa）；輔助氣（Gas2）55 psi；氣簾氣（CG）40 psi；去簇電壓（DP）60 V；一級(jí)碰撞電壓（CE）10 V；二級(jí)碰撞電壓（CE）35 V。

2.3 不同極性提取物對(duì)HUVEC活力的影響

2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%的Gibco胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換1次液，4～5 d傳代1次。選取2～8代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3.2 ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC損傷模型的建立以及給藥濃度的篩選 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化后，輕輕吹打，用含10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，均勻接種于96孔板，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁呈單層融合，棄去上清液，2塊板分別進(jìn)行篩選試驗(yàn)：①分別給予細(xì)胞終濃度為6.25，12.5，25，50，100 mg·L-1的ox-LDL，100 μL/孔，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔；②分別給予細(xì)胞終濃度為12.5，25，50，100，200 mg·L-1茜草炭不同極性部位提取物，100 μL/孔，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，再于37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 g·L-1 MTT 20 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)4 h后，輕輕吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入100 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩器輕輕混勻10 min后，于酶標(biāo)儀上490 nm處讀取各孔吸光度，按下式計(jì)算給藥后對(duì)HUVEC生長(zhǎng)的存活率。

存活率=A給藥組-A空白組

A對(duì)照組-A空白組×100%

2.3.3 茜草炭不同極性部位提取物對(duì)損傷HUVECs活力影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將其消化后均勻接種于96孔板，種板步驟按2.3.2項(xiàng)，將細(xì)胞隨機(jī)分為①正常對(duì)照組：給予細(xì)胞10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)液；②ox-LDL模型組：給予細(xì)胞濃度為25 mg·L-1的ox-LDL；③茜草炭不同極性部位提取物組：分別給予細(xì)胞終濃度為25 mg·L-1茜草炭不同極性部位提取物的同時(shí)加入終濃度為25 mg·L-1的ox-LDL，100 μL/孔，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，再于37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力按2.3.2項(xiàng)。endprint

2.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為有顯著性差異，P<0.01為有極顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 LC-Q-TOF/MS定性分析

通過(guò)查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，建立茜草炭化學(xué)成分庫(kù)，運(yùn)用peak view軟件對(duì)茜草炭4種極性部位提取物中化學(xué)成分一級(jí)質(zhì)量數(shù)進(jìn)行匹配，篩選質(zhì)量數(shù)偏差≤5×10-6的化合物，然后對(duì)其二級(jí)譜圖進(jìn)行解析，依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)化合物碎片離子與判斷化合物裂解方式是否符合該類化合物裂解規(guī)律。

茜草炭各極性部位提取物總離子流圖見(jiàn)圖1，多數(shù)化合物在正負(fù)離子模式下均有較高響應(yīng)，但也有少數(shù)化合物只在某一種離子模式下有響應(yīng)，所以本實(shí)驗(yàn)對(duì)供試品溶液進(jìn)一步進(jìn)行了正離子和負(fù)離子模式的檢測(cè)。

茜草炭中的化學(xué)成分主要為醌類化合物，其離子碎片大多以分子離子失去1個(gè)或多個(gè)羰基（CO）為主，在沒(méi)有取代基的情況下，萘醌和蒽醌都會(huì)連續(xù)失去2個(gè)CO；在有取代基的情況下，蒽醌類化合物主要的裂解途徑亦為逐級(jí)脫CO[6]；醌苷類成分主要裂解途徑是糖苷鍵斷裂，失去糖。本實(shí)驗(yàn)共鑒別出化合物32個(gè)，除了1個(gè)烯萜（茜草哌唑嗪C），其他31個(gè)化合物均是醌類及其糖苷類成分，分別為 5個(gè)萘醌、1個(gè)萘醌苷、17個(gè)蒽醌和8個(gè)蒽醌苷，見(jiàn)表1，其中茜草素、羥基茜草素、1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌、甲基異茜草素、1-羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素由對(duì)照品比對(duì)鑒定，茜草素的質(zhì)譜圖和可能的裂解過(guò)程見(jiàn)圖2。

通過(guò)比較4個(gè)極性部位化學(xué)成分種類發(fā)現(xiàn)，在解析的化合物范圍內(nèi)，茜草炭乙酸乙酯部位鑒定出的化學(xué)成分種類最多有32種，正丁醇部位、石油醚部位次之，分別為26種、23種；水提取部位最少，鑒定出15種化合物。同時(shí)，由于逐級(jí)系統(tǒng)溶劑提取的緣故，化合物基本都分布在前3個(gè)極性部位。石油醚部位主要是一些小極性物質(zhì)，如2-甲基蒽醌，1-羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、1-羥基-3-乙基蒽醌等；乙酸乙酯部位主要是一些中等極性物質(zhì)，如異茜草素、1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌、羥基茜草素、甲基異 茜草素等；正丁醇部位主要是一些較大極性物質(zhì)（蒽醌及蒽醌苷），如1-羥基-2-甲基蒽醌、1，4-二羥基-2-甲基-5/8-甲氧基蒽醌、1，4-二羥基-3-（3′-甲基-2′-丁烯）萘-2-羧酸甲酯-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌-3-O-β-D-吡喃木糖（1→2）-β-D-（6′-O-乙酰基）-吡喃葡萄糖苷；水提取部位化學(xué)成分主要為一些大極性物質(zhì)（蒽醌苷），如1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、1，3-二羥基-2-羥甲基蒽醌-3-O-β-D-吡喃木糖（1→6）-β-D-吡喃葡萄糖苷、1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-（3′/4′/6′-O-乙?；?吡喃葡萄糖苷。

3.2 不同極性部位提取物對(duì)HUVEC活力的影響

3.2.1 ox-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的建立 6.25，12.5，25，50，100 mg·L-1ox-LDL處理組細(xì)胞存活率分別83.38%，61.10%，48.23%，10.04%，9.27%，與正常組（100%）相比，在一定范圍內(nèi)，隨著ox-LDL濃度的增加，細(xì)胞存活率明顯下降，見(jiàn)圖3。當(dāng)ox-LDL的質(zhì)量濃度為10 mg·L-1時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，IC50約為25 mg·L-1，在此條件下細(xì)胞損傷適中，因而確定25 mg·L-1為ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs損傷的劑量。

3.2.2 茜草炭不同極性部位提取物對(duì)HUVEC的體外毒性實(shí)驗(yàn) 為了檢測(cè)茜草炭提取物能否對(duì)HUVECs細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，本實(shí)驗(yàn)選用12.5，25，50，100，200 mg·L-15個(gè)劑量濃度的各極性部位提取物作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs細(xì)胞，作用24 h后，通過(guò)MTT檢測(cè)其存活率，以藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率在10%以內(nèi)為標(biāo)準(zhǔn)確定茜草炭各極性部位提取物對(duì)細(xì)胞無(wú)毒的濃度[28]。與正常組比較，25 mg·L-1的茜草炭各極性部位提取物未對(duì)正常HUVECs細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖產(chǎn)生較大的影響，均無(wú)明顯毒副作用，見(jiàn)圖4。因此，此劑量可作為茜草炭各極性部位提取物的給藥劑量。

3.2.3 MTT法檢測(cè)茜草炭各成分群對(duì)損傷HUVECs活力影響 ox-LDL損傷后，與正常組比較，模型組細(xì)胞的存活率（47.04%）明顯降低（P<0.01），表明ox-LDL可明顯抑制HUVECs活性；與模型組比較，石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水提取部位存活率分別為54.64%，82.22%，67.05%，34.09%，乙酸乙酯部位與正丁醇部位均可顯著提高細(xì)胞活力（P<0.01），而石油醚部位對(duì)細(xì)胞活力影 響并不大，水提部位對(duì)損傷的HUVECs有一定的抑制作用，見(jiàn)圖5。提示茜草炭4個(gè)極性部位提取物化學(xué)成分的不同導(dǎo)致其對(duì)ox-LDL損傷的HUVECs活力的影響不同，乙酸乙酯部位與正丁醇部位具有 明顯的保護(hù)作用，乙酸乙酯-正丁醇極性部位提取物中所含化學(xué)成分很可能為發(fā)揮茜草炭化瘀止血作用的有效成分。

4 討論

茜草炭具有“止血不留瘀”的功效特點(diǎn)，為臨床常用的止血藥，主要用于瘀血內(nèi)阻而導(dǎo)致的出血癥，如咯血、血痢、尿血、崩漏等。止血是一個(gè)有多種細(xì)胞或成份共同參加的一個(gè)復(fù)雜的連續(xù)性過(guò)程，而多種內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的血瘀證以及出血證與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有著密切的關(guān)系[29]。血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅是血液和血管的屏障，而且能通過(guò)分泌各種血管活性物質(zhì)，參與調(diào)節(jié)血小板功能、激活血漿促凝因子、清除活化的凝血因子及纖溶過(guò)程，對(duì)維持正常的血液流變性和血管的舒縮功能具有重要生理學(xué)意義[30]。

本實(shí)驗(yàn)采用ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs損傷模型，研究各極性部位提取物對(duì)損傷HUVECs的保護(hù)作用，結(jié)果表明，乙酸乙酯部位提取物能明顯提高損傷HUVECs的活性，正丁醇次之，關(guān)聯(lián)LC-Q-TOF-MS定性數(shù)據(jù)，乙酸乙酯部位含有鑒定出的所有32種化合物，正丁醇部位含有26種，其對(duì)損傷內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用的差異可能與化合物的種類與極性有關(guān)。茜草炭發(fā)揮化瘀止血的活性成分可能主要集中在乙酸乙酯部位和正丁醇部位的蒽醌及其苷類化合物，這些化合物能通過(guò)提高細(xì)胞活力達(dá)到一定保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用，為后續(xù)探究茜草炭化瘀止血活性成分對(duì)損傷內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的具體作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，對(duì)闡明其化瘀止血功效的物質(zhì)基礎(chǔ)及臨床合理應(yīng)用具有重要意義。endprint

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[責(zé)任編輯 孔晶晶]endprint