預(yù)防豬流行性腹瀉返飼技術(shù)的研究進(jìn)展

廖少山，湯德元，曾智勇，王 彬，黃 濤，胡玲玲，龍冬梅，葉 麗，楊 偉，石元菊，郭倩妤，劉巧玲（貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

PEDV是單股正鏈RNA冠狀病毒，核酸具有感染性，基因組長27000～33000個核苷酸，已測定的PEDV的CV777毒株完整基因組大小為28 033bp[1]。PEDV對外界環(huán)境耐受力很差，喜歡低溫、高濕環(huán)境，可在低溫和高濕環(huán)境中長期存活，但是干燥糞便中的PEDV在37℃條件下4 d內(nèi)死亡[2]。一般的消毒劑對其均有效果，氯仿和乙醚效果最佳。該病最近幾年在全世界迅速流行，中國、東南亞國家、日本、韓國、美國、墨西哥、加拿大流行特別嚴(yán)重，對養(yǎng)豬業(yè)造成的損失特別嚴(yán)重，且有趨勢愈發(fā)嚴(yán)重。是繼“豬高致病性藍(lán)耳病”后，對我國的養(yǎng)豬業(yè)又一迎頭重?fù)?，在我國許多豬場，防控PED是重中之重的工作。對該病目前還沒有可行的治療之法，有時發(fā)病治療后病情會稍有好轉(zhuǎn)，但極易反復(fù)，復(fù)發(fā)后病勢更不可控[3]，可能是加快PEDV的變異而危及整個豬場，甚至導(dǎo)致出現(xiàn)地方性流行。雖有商品性PED滅活疫苗或弱毒疫苗，但由于疫苗質(zhì)量、流行毒株變異、免疫程序影響、產(chǎn)生抗體速度慢等諸多因素導(dǎo)致PED防控效果并不理想。目前，PED暴發(fā)后，豬場普遍采取母豬返飼進(jìn)行應(yīng)急處理，2013年北美暴發(fā)PED疫情后，美國專家力薦返飼，取得了顯著效果[4]。現(xiàn)在我國不少豬場在出現(xiàn)PED疫情后也采用相同的防控措施，效果明顯。但是，縱觀我國養(yǎng)豬行業(yè)，大多數(shù)的技術(shù)人員對于返飼技術(shù)不掌握，當(dāng)PED暴發(fā)時，大多數(shù)豬場不敢進(jìn)行返飼或不能科學(xué)地進(jìn)行返飼防控，只是采取抗菌消炎等方法進(jìn)行保守性綜合治療，徒勞無功，效果甚微。返飼其實(shí)一種古老的、傳統(tǒng)的人工自然免疫方法，返飼就是將含有活病原菌的病料給豬定期喂食，促使豬體受到輕微感染刺激而又不表現(xiàn)出致病，在感染刺激下豬體內(nèi)慢慢地產(chǎn)生抗體而起到免疫該病的作用[5]，對母豬返飼是讓妊娠母豬產(chǎn)生免疫（類似于接種口服弱毒苗），從而使新生仔豬通過哺乳獲得母源抗體，能抵抗病毒感染的過程[6]。簡義虎等[7]設(shè)計試驗(yàn)，研究返飼母豬血清中IgG、IgA抗體水平和對母豬體外排毒情況進(jìn)行檢測，結(jié)果表明：母豬在返飼后第11 d豬血清中IgG抗體明顯上升，并在第20 d IgA與IgG檢測值均達(dá)至最高，返飼后第2 d開始向外排毒，在第15 d唾液與糞便均未檢測到PEDV。證明在母豬產(chǎn)前15～30 d返飼效果最好，病毒感染仔豬的概率最低，為臨床防控該病提供理論依據(jù)。羅鵬等[8]設(shè)計試驗(yàn)，用PED滅活疫苗和弱毒疫苗對待產(chǎn)母豬進(jìn)行免疫，與同類母豬進(jìn)行返飼形成對照，檢測兩組母豬產(chǎn)生抗體的速度和水平，試驗(yàn)結(jié)果表明：采取母豬返飼比接種滅活疫苗免疫產(chǎn)生抗體更快，效果更好，而疫苗免疫雖然能起到一些作用，但是抗體產(chǎn)生速度太慢，小豬得不到及時保護(hù)，很難及時控制住PED對豬場造成的損失。齊海濤等[9]試驗(yàn)表明：返飼能有效地控制冠狀病毒、輪狀病毒的感染，只要使用科學(xué)返飼技術(shù)進(jìn)行返飼管理，從實(shí)踐來看，科學(xué)對母豬返飼是可以有效地控制PED的。

1 人工母豬返飼簡述

在PED的暴發(fā)時，束手無策的豬場通常會使用妊娠母豬返飼來防控該病，減少經(jīng)濟(jì)損失。返飼其實(shí)是一種古老的傳統(tǒng)的人工主動免疫方法，返飼就是當(dāng)突發(fā)某種疫病而又無可行的治療方法情況下，將含有活病原菌的病料給豬定期喂食或適量肌肉注射，促使豬體受到輕微感染刺激而又不表現(xiàn)致病，感染刺激下豬體內(nèi)慢慢地產(chǎn)生抗體而起到免疫該病的作用，母豬返飼是用上述方法，先讓妊娠母豬產(chǎn)前產(chǎn)生免疫（類似于接種口服弱毒苗），從而使新生仔豬通過哺乳獲得母源抗體，可抵抗病毒感染而起到自我保護(hù)的過程。

其人工母豬返飼原理可簡單表述如下：（提取活病原體）腸道感染病毒－（病毒感染）病毒在腸道復(fù)制－黏膜識別免疫刺激－淋巴遷移、乳腺淋巴細(xì)胞和免疫刺激－乳汁中抗體增加－對哺乳仔豬產(chǎn)生保護(hù)力[10]。

2 返飼樣品的制備

選擇7日齡之內(nèi)發(fā)病第2 d的活仔豬(最好出現(xiàn)腹瀉之前有嘔吐癥狀的仔豬)進(jìn)行撲殺，因?yàn)榘l(fā)病初期哺乳活仔豬腸道中PEDV含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于母豬和死亡仔豬腸道中的PEDV含量，2～5日齡仔豬，在開始出現(xiàn)癥狀至18 h內(nèi)，其腸道收集到的病毒含量和其毒力是最高的，（在臨床觀察和實(shí)驗(yàn)室檢測中發(fā)現(xiàn)）因?yàn)槌跎胸i小腸的絨毛比較長，其上邊具有更多數(shù)量的成熟的小腸上皮細(xì)胞，這些上皮細(xì)胞非常有利于PEDV的繁殖。然后放血，并對體表進(jìn)行清潔、消毒，剖開腹部，暴露出腹部腸管，在十二指腸與空腸的交界處和空腸與回盲交界處用縫線雙結(jié)扎，用手術(shù)剪剪下雙結(jié)扎點(diǎn)之間的小腸，連同小腸內(nèi)容物一并收集，含毒量相對較高的其他內(nèi)臟也可適量收集，存放于病料袋中，置低溫?zé)o菌暗光下單獨(dú)保存并記錄仔豬的耳號。保存的同時，取少量病料迅速進(jìn)行PEDV鑒定，經(jīng)檢測為PEDV為陽性，并排除可能含有其他烈性病原體，如豬藍(lán)耳病、豬偽狂犬病和豬瘟等病毒。確定病料安全有效后，把所有返飼病料剪成碎塊，放入5 ℃等量牛奶中或PBS液中，用組織勻漿機(jī)制成勻漿，經(jīng)100目篩過濾。在勻漿中加入適量抗生素如慶大霉素3 mL、新霉素1 g、硫酸黏菌素2 g/100 g組織，對勻漿稀釋 (如8 mL鮮牛奶或PBS液/g組織)。有條件時，可配合熒光定量PCR[11]測定返飼病料中病毒的拷貝數(shù)，返飼病料及時置低溫（4 ℃）、陰暗條件下保存，如不當(dāng)天使用而需要保存于-40℃的冰柜中備用。

3 人工返飼步驟

3.1 在母豬妊娠階段合理營養(yǎng)

日糧中可以適量加入適量的低分子脂肪酸，可提高初乳中蛋白質(zhì)、免疫球蛋白和不飽和脂肪酸等營養(yǎng)、免疫物質(zhì)含量，從而增強(qiáng)仔豬抵御病原體特別是腸道病原體的能力，減少哺乳仔豬的腸道疾病[12]。返飼前1周開始在飼料中添加抗生素、多維和葡萄糖，飲水中清除細(xì)菌和球蟲，增加返飼母豬的體質(zhì)。對懷孕后期的母豬飼料中添加腸肽2000 g+綠益態(tài)1000 g/t。連續(xù)飼喂7～10 d，可促進(jìn)母豬的泌乳功能[13]。

3.2 每頭返飼用量10 mL上述制備液

但具體用量可以根據(jù)實(shí)際情況，調(diào)至效果最佳劑量，病料拌入飼料或飲水中一次性投喂，整個豬場最好全場同1 d投喂完。返飼后母豬出現(xiàn)輕微腹瀉癥狀，則效果最好，母豬一般2～3 d后會自然恢復(fù)，若豬群以前發(fā)生過腹瀉并做過返飼，出現(xiàn)癥狀的豬數(shù)量在10%左右，若近期免疫過相關(guān)疫苗，出現(xiàn)上述癥狀的返飼豬數(shù)達(dá)到50%以上，如果種豬群沒有免疫過相應(yīng)疫苗，則以80%以上豬出現(xiàn)癥狀視為返飼成功，否則要進(jìn)行再次返飼。

3.3 效果檢測

有條件的豬場可以在返飼前后采取血清和糞便做ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）進(jìn)行檢測[14]，用ELISA方法既可以檢測抗原也可以檢測抗體水平來判斷返飼的效果。

4 人工返飼的應(yīng)用現(xiàn)狀

2013年北美暴發(fā)PED疫情后，開始也是束手無策，損失慘重，無奈之下美國專家們力薦返飼，采取母豬返飼措施后損失減少，取得了顯著效果。2014年Matthew B等[15]在美國進(jìn)行調(diào)查分析表明，當(dāng)PEDV在全陰性豬場暴發(fā)PED后愿意立即開始或繼續(xù)對母豬PEDV返飼馴化的占84%，對主動返飼的688家豬場進(jìn)行返飼效果統(tǒng)計，結(jié)果顯示有604家豬場返飼效果明顯，占88%，84家豬場返飼效果不明顯，占12%。國內(nèi)返飼成功的案例也多有報導(dǎo)，2013年陳桂華等[16]對邵陽某規(guī)?；i場實(shí)施返飼防控，返飼后2～5 d母豬出現(xiàn)嘔吐和輕微腹瀉癥狀，第5 d后病情逐漸好轉(zhuǎn)，未見到母豬流產(chǎn)等其他不適反應(yīng)，經(jīng)返飼后母豬共產(chǎn)下259窩仔豬，仔豬未出現(xiàn)嘔吐、水樣腹瀉等癥狀，則表明該豬場PED得到有效控制，表明通過返飼母豬及配合其他相應(yīng)的飼養(yǎng)管理措施預(yù)防PED具有較好的效果。2014陳志林等[17]在某大型豬場發(fā)生PED期間實(shí)施返飼母豬，通過結(jié)果分析表明采取返飼母豬措施后效果顯著，大大地降低初生仔豬在PED暴發(fā)時的腹瀉率和死亡率。齊海濤等試驗(yàn)表明返飼也能有效地控制冠狀病毒、輪狀病毒的感染。2017年四川某規(guī)?；B(yǎng)豬場發(fā)生腹瀉疫情，開始病情難以控制，后來采取以返飼母豬為主要措施的綜合防控方案，方案執(zhí)行1個月后疫情得到有效控制，發(fā)病率由原來的90%以上降低到10%以下[18]。

5 母豬返飼的利弊

5.1 返飼的優(yōu)點(diǎn)

病料是自家豬場的病豬，取材方便、低廉，如不采集病料，對于豬場內(nèi)病、死豬也要及時進(jìn)行無害化處理，也是“廢物利用”，同時也是清除病源控制疫病擴(kuò)散的好辦法，一舉三得。其方法可操作性強(qiáng)，簡單易學(xué)，容易上手，會操作人群廣泛，一般的專業(yè)技術(shù)人員皆可操作，需要設(shè)備與器材簡單，一般只需要可調(diào)高速組織搗碎機(jī)（家用絞肉機(jī)也可）、冰箱、電子秤（精確到0．1 g）、手術(shù)刀、剪刀、涼的生理鹽水、新鮮牛奶或PBS液、一次性手套、攪拌棒、樣品袋、消毒桶、消毒劑、工作服、膠鞋等，大部分都是豬場常備的，所需要的藥品只有適量的抗生素。當(dāng)發(fā)病毒株的毒力強(qiáng)、病毒滴度高，免疫原性好，產(chǎn)生抗體速度快，母豬返飼效果好。母豬可在返飼2周后產(chǎn)生抗體，而且抗體在母豬體內(nèi)的消退速度慢[19]，返飼后機(jī)體產(chǎn)生抗體的速度要快于疫苗免疫，豬在返飼后第11 d豬血清中IgG抗體明顯上升，并在第20 d IgA與IgG檢測值均達(dá)至最高，這樣就可對即將（兩周后）產(chǎn)仔的母豬進(jìn)行返飼，對仔豬起到免疫保護(hù)作用；但是疫苗免疫產(chǎn)生抗體速度沒有這么快，很難實(shí)現(xiàn)及時免疫。返飼病料是取自家豬場病豬，病原體是來自于自己豬場所發(fā)之病，刺激母豬產(chǎn)生的抗體就是抗該病原體抗體，對本豬場病原體針對強(qiáng)，特異性好，能在較短時間內(nèi)終止疫病流行降低損失[20]，就算該豬場此次發(fā)病病原體是變異毒株，此法也能起到免疫效果，但是疫苗免疫就不可能做到，疫苗免疫面對毒株變異時不但沒有效果，反而會適得其反，導(dǎo)致病情加重。

5.2 返飼的缺點(diǎn)

如果返飼的病料是變異強(qiáng)毒株，沒有經(jīng)滅活或馴化等生物安全性處理，很可能使強(qiáng)毒株蔓延到整個豬場，而且還有可能導(dǎo)致強(qiáng)毒株地方流行，存在暴發(fā)疫病或散毒的風(fēng)險；同時返飼病料中可能帶有其他病原體，如豬藍(lán)耳病毒、偽狂犬病毒等強(qiáng)毒，這樣的返飼反而成了散毒；返飼只針對PED，對其他病原體引起的腹瀉并沒有效果。而且母豬返飼僅適用于哺乳仔豬發(fā)生PED之際，沒有發(fā)生此疫情時不得提前進(jìn)行返飼預(yù)防；對2周內(nèi)待產(chǎn)的妊娠母豬和哺乳期母豬也不能進(jìn)行返飼，因?yàn)闊o法做到確保初乳中含有母源性抗體，及時使仔豬產(chǎn)生免疫力，而且還有排毒的隱患。返飼病料若病毒劑量不夠或病毒滴度不高，不能夠使母豬產(chǎn)生足夠的病毒抗體，易造成返飼無效或?qū)е聶C(jī)體復(fù)發(fā)感染。返飼病料中含有大量的其他抗原，如異己蛋白抗原，會使其母豬機(jī)體受到強(qiáng)制免疫應(yīng)激，母豬抵抗能力下降而感染其他疾病，同時，過度的免疫刺激，還有可能導(dǎo)致懷孕母豬流產(chǎn)、產(chǎn)弱胎與死胎，后備母豬不發(fā)情。初發(fā)PED的仔豬中所取得的病料，利用剛出生還未吃初乳的仔豬感染發(fā)病進(jìn)行病毒擴(kuò)增成本高、速度慢，現(xiàn)在的豬場規(guī)?；潭仍絹碓礁?，母豬數(shù)量巨大，難以滿足整個豬場母豬需要的返飼病料量，常因沒有足夠的病料很難實(shí)現(xiàn)全場同時免疫。此法只能作為應(yīng)急措施，也未能先知先用、防范于未然，只能在減少豬場損失上發(fā)揮作用，不可能做到零損失。如果返飼的母豬，可能已經(jīng)感染其他病原體，經(jīng)過返飼，很可能導(dǎo)致母豬復(fù)合感染，或者原有的感染加重或加速呈現(xiàn)病癥。

5.3 返飼過程及注意事項(xiàng)

病料加工處理過程中使用過的器皿和廢棄病料，要及時進(jìn)行消毒或銷毀處理。病料的加工、返飼、無害化處理都應(yīng)由專人負(fù)責(zé)，每次進(jìn)出加工區(qū)域要經(jīng)過嚴(yán)格消毒，其他無關(guān)人員不得進(jìn)入病料加工區(qū)域；返飼后12 d內(nèi)專業(yè)技術(shù)人員不得換崗或替換。配懷舍母豬不能進(jìn)產(chǎn)房，但產(chǎn)房斷奶母豬隨時可以進(jìn)配懷舍；返飼后2 d內(nèi)配懷舍不作消毒，發(fā)病豬前2 d可不作治療，這種方法可能會導(dǎo)致少量母豬流產(chǎn)，尤其是配種后1月的母豬，所以切勿盲目加大返飼劑量。在2周內(nèi)待產(chǎn)母豬和哺乳期母豬不得進(jìn)行返飼；對每頭母豬盡量做到返飼一次性成功，不宜反復(fù)長時間返飼。母豬返飼是在豬場發(fā)生PEDV野毒感染時預(yù)防新生仔豬發(fā)生腹瀉的常用應(yīng)急措施，而不能適用于緊急免疫；要做到仔豬吃上初乳，有的仔豬吃不到母乳或哺乳不足時，必須采取人工喂養(yǎng)。返飼后注意消毒處理，母豬的腹瀉糞便必須進(jìn)行無害化處理，可用生石灰進(jìn)行掩蓋并及時運(yùn)出圈舍統(tǒng)一處理，對整個豬場大環(huán)境也要進(jìn)行消毒，防止豬圈內(nèi)傳播，可用挑戰(zhàn)的金盾消毒劑，按照1： 300與水混合后，使用消毒車對豬舍進(jìn)行大規(guī)模的噴灑消毒，每天早晚各噴灑消毒一次，并及時采取圈舍隔離措施，防止病毒擴(kuò)散。PEDV對光照和溫度都不穩(wěn)定，病毒脫離動物后會很快死亡，其抗原性發(fā)生改變而削弱了返飼效果，加工好的病料若不能立即使用，必須置低溫（4 ℃）、陰暗條件下保存[21]。在返飼后，對于出現(xiàn)腹瀉的母豬，要利用抗生素預(yù)防細(xì)菌感染以及添加電解質(zhì)多維及時補(bǔ)水和防止酸中毒[22]；若有采食量下降的現(xiàn)象，需要添加魚肝油、維生素及電解質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)對腹瀉康復(fù)的母豬進(jìn)行增膘，防止返飼母豬偏瘦[23]；若返飼后的部分待配母豬出現(xiàn)發(fā)情推遲，可在飼料中添加葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)，促其發(fā)情，對發(fā)情狀態(tài)難以恢復(fù)的母豬可做推期配種。

綜上所述，當(dāng)前PED在我國并沒有消滅，各地呈偶爾散發(fā)態(tài)勢，隨時可能卷土重來，PED仍是豬場面臨的巨大挑戰(zhàn)。很多養(yǎng)豬人會發(fā)現(xiàn)，即使已精心做好流行性腹瀉疫苗的免疫接種，豬場依然會有PED發(fā)生，且疫苗的價格不菲，有時花了錢也沒有得到期望的結(jié)果。因此如何做好豬場PED的防控需要更多的養(yǎng)殖人員及科研工作者以科學(xué)的態(tài)度對待PED的防控，當(dāng)PED來臨時，要根據(jù)臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室診斷，然后通過母豬返飼，利用自家毒株去引誘豬體產(chǎn)生抗體，仔豬通過哺乳獲得母源性抗體來提升仔豬抗病能力，起到控制疫情的效果。但是返飼又是一把鋒利的雙刃劍，當(dāng)豬場發(fā)生腹瀉時要冷靜、科學(xué)分析，確定引起仔豬腹瀉的病原為PEDV，并排除不含有其他烈性病原體感染后再進(jìn)行返飼，嚴(yán)格按照科學(xué)的方法進(jìn)行返飼，認(rèn)真操作，及時監(jiān)控疫情，病情無法控制時要以大局為重，可以選擇性撲殺，尸體無害化處理來控制疫情擴(kuò)散[24]。盡管返飼技術(shù)存有缺陷，而且應(yīng)用上有一定的限制，但在目前尚無有效控制PED措施的現(xiàn)實(shí)情況下，不能否認(rèn)其積極的作用。PED疫病發(fā)生后，對于束手無策的豬場，考慮通過母豬返飼的措施來進(jìn)行防控，無疑是首選的方案，應(yīng)當(dāng)及時采取人工母豬返飼；專業(yè)技術(shù)人員認(rèn)真按照科學(xué)的返飼技術(shù)步驟對母豬進(jìn)行人工返飼，仔細(xì)排查返飼注意事項(xiàng)，返飼技術(shù)的缺點(diǎn)是可以克服的。在今后的研究、工作中還需多加總結(jié)、科學(xué)分析，力求完善返飼技術(shù)，穩(wěn)定返飼效果。