豬的基因編輯技術現狀與展望

張文舉，楊 智，王曉圓

（1.吉林省梨樹縣孤家子鎮(zhèn)畜牧站動物檢疫監(jiān)督所，吉林 梨樹 136506；2. 安徽省太和縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，安徽 太和 236600；3.吉林省吉林市船營區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，吉林 吉林132000）

1 介紹

基因編輯是指通過基因工程技術對生物體的特定基因進行精確改造，包括刪除，替換或插入單個核苷酸或某段DNA序列，以達到預期的基因型或表型。目前，應用較廣泛的基因編輯技術主要有三類，包括鋅指核酸酶（Zincfingernucleases,ZFNs）、類轉錄激活因子核酸酶（Transcriptionactivatorlikeeffectornucleases,TALENs）和規(guī)律間隔的短回文重復序列相關核酸酶（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR/Cas）?，F如今應用最廣泛的基因編輯技術為CRISPR/Cas9系統(tǒng)，被廣泛地應用到生物學、農業(yè)、醫(yī)學和臨床等多個領域，用該技術制備基因編輯動植物等已有數十種，且效率高，速度快。在動物育種、醫(yī)學模型、器官移植和臨床治療等領域都表現出巨大的應用價值。在CRISPR/Cas系統(tǒng)尚未問世以前，制備基因編輯動物是非常困難的，因為成本高、周期長、操作繁瑣，尤其是制備大動物豬、牛、羊等。在科研人員的不斷努力下，使得CRISPR/Cas系統(tǒng)面向世人，才把制備基因編輯動物變得簡單容易，尤其是基因編輯豬。隨著人們生活水平提高，逐漸對豬肉的品質有更高的需求，如瘦肉率、肌內脂肪、酸堿度和肉色等性狀。需求的增加導致越來越多的豬育種人員及大型養(yǎng)殖企業(yè)采用基因編輯豬育種，以滿足市場和人們的需求。豬與人的親緣關系近，體型大小和生理病理等特征與人相似，是比較合適的醫(yī)療模型和器官移植供體。因此，世界各地的科研工作者不斷地利用基因編輯技術制備基因編輯豬。而我國是制備基因編輯豬最多的國家，已經在豬育種，醫(yī)療模型上取得了突破的進展。文章將結合基因編輯豬在各領域的應用狀況，存在的問題及潛在的應用前景進行闡述。

2 新型基因編輯技術

在科研人員的不斷努力下，基因編輯技術迅速發(fā)展，從傳統(tǒng)基因編輯技術發(fā)展到新型基因編輯技術，技術體系被不斷地完善。從傳統(tǒng)的效率低、成本高、周期長和操作繁瑣到新型的效率高、成本低、周期短和操作簡單，使得基因編輯技術趨于簡單化，規(guī)?；?，在制備基因編輯動物方面也變得輕而易舉。如今，全球多家大型育種公司和企業(yè)均已利用新型基因編輯技術制備規(guī)?；幕蚓庉嬝i進行育種。各科研院所也制備了數十種基因編輯動物模型。

2.1 鋅指核酸酶技術在基因編輯豬上的應用

鋅指核酸酶（Zincfingerproteins，ZFPs）又稱鋅指蛋白核酸酶（ZFPNs），是第一代人工合成的核酸內切酶。由鋅指蛋白識別DNA與靶標結合，通過FokI內切酶對靶標進行切割，最終導致DNA雙鏈斷裂[1]。ZFN技術是第一種能夠誘導非同源末端連接或同源重組途徑的基因敲除或基因敲入技術，該技術打破了無法制備對特定基因進行編輯的基因編輯豬。2010年，Watanabe等用ZFN技術成功制備了基因編輯豬，這是首次利用ZFN技術得到的基因編輯豬[2]。2011年，Yang等利用ZFN技術制備了敲除PPAR-γ基因豬模型用來研究人的心血管疾病[3]。2013年，Kwon等利用ZFN技術制備了CMP-Neu5Ac基因編輯豬，為異種器官移植提供了一個良好的模型。在鋅指核酸酶技術問世之初，曾被大量的優(yōu)化和改造[4]，但由于構建步驟比較繁瑣，耗時長，成本高，最終應用到基因編輯動物方面應用較少。

2.2 類轉錄激活因子核酸酶技術在基因編輯豬上的應用

類轉錄激活因子核酸酶技術（Transcriptionactivatorlikeeffectornucleases,TALENs）， 俗稱TALEN，是第二代人工合成核酸內切酶。它是由可識別靶標的TAL效應因子與FokI內切酶組合而成，可對靶標實行定點修飾[5]。與ZFN技術累似，通過蛋白識別DNA序列，利用FokI內切酶對基因組進行剪切。相比ZFN技術，TALEN技術應用更為廣泛，且效率高[6]。因此，TALEN技術在豬上的應用相對較多。2012年，Carlson利用TALEN技術獲得了LDL受體基因編輯豬，為家族性高膽固醇血癥提供了醫(yī)療研究模型[7]。2014年，Huang等利用TALEN技術制備了RAG1/2基因敲除豬，成功制備了重癥免疫缺陷豬模型[8].2014年，賴良學實驗室人員利用TALEN技術在Rosa26位點成功制備了基因敲入工豬模型，用以追蹤豬細胞譜系[9]。雖然TALEN技術相比ZFN技術構建容易，但TAL蛋白無法識別一些特定的序列，且工作量較大，這使得TALEN技術在制備基因編輯豬上有一定的限制。

2.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因編輯豬上的應用

CRISPR/Cas9是第三代人工核酸內切酶，與ZFN技術和TALEN技術最大區(qū)別在于識別靶標不同，CRISPR/Cas9是通過向導RNA與靶標互補配對，招募Cas9蛋白對基因組進行切割[10]。CRISPR/Cas9自2003年問世以來，被世界各地大小實驗室廣泛使用，相比ZFN和TALEN，CRISPR/Cas9系統(tǒng)操作更為簡單快速、成本低和效率高，很有可能完全取代ZFN技術和TALEN技術。經過幾年的發(fā)展和改進，CRISPR/Cas9系統(tǒng)猶如“上帝的手術刀”，在農業(yè)，醫(yī)療和臨床等諸多領域都體現出是一種前所未有的分子生物學研究手段的革新技術。

2.3.1 基因編輯豬應用到豬育種

基因編輯豬育種能夠對豬進行快速的遺傳改良，短時間內就能夠獲得自然狀態(tài)下經過長期自然選擇才能獲得的表型。2015年，Wang等利用CRISPR/Cas9技術獲得了MSTN基因敲除豬，陽性豬出現了明顯的雙肌臀表型[11]。MSNT基因突變表現雙肌臀的現象在自然環(huán)境中需要經過長期的自然選擇才能獲得，然而通過基因編輯技術，在短短的幾個月就能獲得大量的突變群體，極大地縮短了豬育種進程。2017年，Burkard等人利用CRISPR/Cas9技術敲除豬藍耳病受體CD163基因的一個結構域，最終實驗證明敲除豬能夠抵抗豬藍耳病毒的感染[12]。自此之后，多家育種公司和科研院所開啟了抗豬藍耳病基因編輯豬育種，并成功獲得了抗豬藍耳病豬群體。2017年，Zhang等利用CRISPR/Cas9技術培育出了基因編輯抗寒豬，研究人員將小鼠的UCP1基因定點敲入到豬的基因組中，實現了UCP1基因在豬白色脂肪組織的特異表達，減少脂肪沉積，增加瘦肉率，同時提高了豬的抗寒能力[13]。2018年，周琪院士和王皓毅研究員團隊利用CRISPR-Cas9技術制備了IGF2基因第三個內含子一個保守的SNP位點編輯巴馬豬。與野生型巴馬豬相比，IGF2基因編輯豬表現出體重、胴體重和瘦肉率等方面都顯著提高[14]。2018年，Zhang等利用CRISPR/Cas9技術將四個來自微生物的酶類基因轉入豬基因組中，培育出污染顯著減少、節(jié)約糧食且生長快速的基因編輯豬[15]。

2.3.2 基因編輯豬應用到醫(yī)療模型

基因編輯豬疾病模型的建立主要是為了研究人類疾病。除了豬以外，模式動物小鼠也是一種很好的人類疾病模型。與小鼠相比，豬的習性，器官和組織等與人類具有較高的相似性，因此豬作為疾病模型研究人類疾病是比較理想的模型。2014年，Hai等利用CRISPR/Cas9技術制備了vWF基因敲除豬，獲得了血友病基因編輯模型豬[16]。同年，Peng等利用CRISPR/Cas9技術將人白蛋白基因定點敲入豬的基因組中，從而達到能夠從豬的血清中獲得人的白蛋白[17]。2015年，Chen等利用該技術獲得了B細胞缺陷型基因編輯豬[18]。2018年，Yan等首次利用CRISPR/Cas9技術和體細胞核移植技術，成功培育出世界首例亨廷頓舞蹈病基因敲入豬。它能精準地模擬出人類神經退行性疾病，為治療“亨廷頓舞蹈病”、老年癡呆等疾病提供了理想的動物模型[19]。

2.3.3 基因編輯豬應用到異種器官移植

與其他模式動物相比，豬的生理特征更與人類相似，尤其是器官大小與功能非常接近。因此通過制備基因編輯豬，對異種器官移植研究具有重要價值。2014年，Sato等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除豬的α-GalT基因，消除了豬和人的異種器官移植的排斥問題，為人類器官移植探究提供了很好的模型[20]。2015年，哈佛大學和eGenesis公司的Yang等研究人員利用CRISPR/Cas9技術，敲除了豬內源的PERVs基因，解決了豬器官用于人體移植的重大難題[21]。

3 問題與展望

基因編輯技術的出現是現代分子生物學技術的一大飛躍，每一代新的核酸內切酶的出現都會帶來極大的突破，使得制備基因編輯動物的主要困難不再受技術因素的制約。如今，科研人員很容易能夠獲得理想的基因編輯動物模型，從模式動物的小鼠到豬，羊和牛等大的哺乳動物，甚至靈長類的基因編輯猴子。然而，一個強大的技術往往都伴隨有致命的缺點，限制基因編輯動物發(fā)展的最大缺點是脫靶問題。所謂脫靶就是在對靶基因進行剪切的同時，往往可能在生物體基因組的未知區(qū)域進行剪切，而且很難進行檢測，最終可能造成細胞毒性。若是基因編輯動物出現脫靶現象，可能對動物個體造成無法預測的表型。迄今為止，制備的基因編輯豬均沒有進行過系統(tǒng)的脫靶檢測，即使外觀，生理生化指標等檢測正常，但基因組某些區(qū)域是否被剪切仍是未知。

制備基因編輯豬最常用到的是體細胞核移植技術，目前該技術最大的缺點仍然是效率很低。雖然通過直接注射受精卵的效率相對較高，但是獲得的F0代基因編輯豬大多數都是嵌合體，為了獲得純合子，需要經過配種擴群。因此，制備基因編輯豬的成本仍然是很高的，制約了規(guī)?；B(yǎng)殖的進程。

轉基因食品安全性是制約基因編輯動物推廣的最大制約因素。理論上基因編輯動物不屬于轉基因范疇，很多基因編輯動物是模仿自然突變，只是通過人為手段較快地獲得突變個體。近幾年，轉基因三文魚和基因編輯蘑菇相繼上市，說明了人們對轉基因食品逐漸變得越來越認可。各個國家也根據本國的國情制定了相應的評價標準和體系，相信在不久的將來轉基因食品都能被公眾所認可。

基因編輯技術革新了分子生物學的研究手段，為動物育種，疾病治療和臨床應用帶來了前所未有的希望。在科研人員的不斷探索和努力下，基因編輯技術體系會不斷地得到完善，新的基因編輯技術也會相繼被挖掘，希望最終能夠使基因編輯技術被廣泛應用到多種領域中。

參考文獻略。（如有需要請與作者聯系。）