組蛋白甲基化轉移酶2在糖尿病腎病小鼠腎組織中的表達變化及其意義

簡久瑩 張妮 余婷 王笑笑 伍聰聰 徐衛(wèi)衛(wèi) 郭兵 劉麗榮

1貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院臨床檢驗中心（貴陽550004）；2貴州醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院臨床血液學教研室（貴陽550004）；3貴陽市第一人民醫(yī)院輸血科（貴陽550002）；4貴州醫(yī)科大學貴州省常見慢性疾病發(fā)病機制及藥物研究重點實驗室（貴陽550025）

糖尿病是一種臨床上常見的糖代謝障礙性疾病。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟最新報道，中國糖尿病患病率為10.9%，糖尿病患者數(shù)量約為1.14億，位居世界第一［1］。糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是其最嚴重的微血管并發(fā)癥之一，最終發(fā)展至終末期腎衰竭［2］。上皮細胞-間充質(zhì)細胞轉化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）是導致DN腎臟纖維化發(fā)生的機制之一，其特點是上皮表面標志物的丟失，間充質(zhì)標志物的獲得和細胞骨架重塑［3-6］。眾所周知，轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是EMT發(fā)生的重要誘導因子［7-8］，但其具體作用機制仍知之甚少。

研究發(fā)現(xiàn)［9-10］，在TGF-β1誘導的腎小球系膜細胞中，細胞外基質(zhì)的沉積與組蛋白H3第4位賴氨酸甲基化（H3K4me）水平增加有關，可見組蛋白甲基化是促纖維化的一個關鍵因素。組蛋白甲基化轉移酶2（SET and MYND domain containing 2，SMYD2）是一種含有SET結構域的組蛋白甲基化轉移酶。有研究［11］表明，SMYD2在正常腎組織中低表達，在腎癌組織中高表達，提示其參與腎癌的發(fā)生發(fā)展。SMYD2在腎囊腫組織中呈高表達狀態(tài)，其通過甲基化核轉錄因子κB和信號轉導與轉錄激活因子3使其磷酸化活化，促進囊性上皮細胞分泌多囊蛋白和炎性細胞因子，進而促進囊腫的生長［12-13］。由此可見SMYD2與腎臟疾病密切相關，但SMYD2在DN研究領域尚未見報道。因此，本研究構建了DM模型小鼠，探討SMYD2在DM腎組織中的表達變化，為臨床治療DN提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑蛋白提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物有限公司；STZ（S0130）、α-SMA（A5228）和Vimentin（V5255）購自sigma公司；β-actin（bs-0061R）購自北京博奧森生物技術有限公司；SMYD2（D14H7）購自Cell signaling公司；E-cadherin（20874-1-Ap）購自Proteintech公司；TGF-β1（ab92486）購自abcam公司。

1.2 實驗動物與分組24只無特定病原體（SPF）級健康雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，6周齡，購買于斯貝福（北京）生物技術有限公司［許可證號：SCXK（京）2016-0002］。隨機將24只小鼠分為正常對照（NC）組、DM12周組、DM24周組、DM28周組，每組6只。按55 mg/kg劑量腹腔注射鏈脲佐菌素復制DM小鼠模型，1次/d，連續(xù)注射5 d。48 h后尾靜脈取血測隨機血糖，血糖＞16.7 mmol/L且尿糖陽性者判定為造模成功，NC組給予相同劑量STZ溶媒。各組小鼠給予標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水，分別于造模后第12周、24周和28周處死DM各組小鼠，于第28周處死NC組小鼠。小鼠處死前6 h禁食不禁水，麻醉后眼球摘除法取血，3 500 r/min離心5 min分離血清，凍存于-80 ℃冰箱保存。將腎組織一分為二，1/2浸泡在含4%多聚甲醛，用于觀察腎組織病理學改變；另1/2凍存于-80 ℃冰箱，用于相關蛋白的檢測。

1.3 全自動生化分析儀檢測生化指標全自動生化分析儀檢測各組小鼠血糖（blood glucose，BG）、血肌酐（serum creatinine，Scr）和尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）。

1.4 HE、Masson 染色觀察腎臟病理學改變HE染色：將浸泡在含4%多聚甲醛的腎組織進行石蠟包埋，再用切片機制作厚度約為3 μm的石蠟切片，脫水透明后進行HE染色，光學顯微鏡下進行分析。Masson染色：采用Masson三色染色試劑盒對已制備好的石蠟切片進行染色，光學顯微鏡下進行分析。

1.5 Western blot 檢測腎組織中SMYD2、E-cadherin、α-SMA、Vimentin 和TGF-β1 蛋白水平的變化蛋白上樣工作液的制備：將0.02 g腎組織和200 μL蛋白裂解液置于玻璃勻漿器內(nèi)，研磨后離心，吸出上清液；采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定上清液的蛋白濃度；將一定量蛋白原液和5×蛋白上樣緩沖液按比例制備1×蛋白上樣工作液。Western blot：制備SDS- PAGE凝膠，將制備好的上樣工作液上樣進行電泳、轉膜和封閉。分別加入一抗：SMYD2（1∶500）、E-cadherin（1∶10 000）、α-SMA（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、TGF-β1（1∶1 000）和β-actin（1∶5 000），4 ℃搖床孵育過夜。取出PVDF膜，室溫孵育二抗1 h，TBST洗膜3次，ECL化學發(fā)光顯影。Image J 1.44軟件計算各條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白與β-actin的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用方差分析，采用Spearman秩相關檢驗進行相關性分析。P ＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 各組小鼠血糖水平生化檢測結果顯示：與NC組 相 比，DM12周 組、DM24周 組、DM28周 組BG、Scr和BUN水平均明顯增高（P ＜0.05，表1）。

表1 各組小鼠BG、Scr 和BUN 的變化Tab.1 The results of BG，Scr and BUN in each group ±s

表1 各組小鼠BG、Scr 和BUN 的變化Tab.1 The results of BG，Scr and BUN in each group ±s

注：與NC 相比，*P ＜0.05

組別NC DM12 周DM24 周DM28 周BG（mmol/L）7.42±1.01 31.84±9.54*34.77±3.92*33.63±3.29*Scr（μmol/L）7.80±0.08 9.53±0.33*9.86±1.54*10.13±0.63*BUN（mmol/L）6.80±0.16 8.67±1.96*9.45±0.97*9.64±1.31*

2.2 各組小鼠腎組織病理學變化HE染色結果顯示：NC組小鼠腎小球形態(tài)、結構完整，腎小管基底膜完整，上皮細胞排列整齊，未見炎性細胞浸潤；DM12周組小鼠的腎組織病理學改變不明顯；DM24周組小鼠少量腎小球出現(xiàn)系膜細胞增生，偶見腎小管空泡變性；DM28周組小鼠腎組織中部分腎小球出現(xiàn)系膜細胞增生，且有少量基底膜增厚，腎間質(zhì)出現(xiàn)炎性細胞浸潤，部分腎小管發(fā)生顆粒變性和空泡樣變（圖1）。Masson染色結果顯示：NC組小鼠腎間質(zhì)無纖維增生；DM12周組小鼠腎間質(zhì)纖維增生不明顯，DM24周組小鼠腎間質(zhì)出現(xiàn)少量纖維增生，DM28周組小鼠纖維增生程度明顯（圖1）。

2.3 各組小鼠腎組織中E-cadherin、α-SMA、Vimentin 的蛋白水平變化與NC組相比，DM組小鼠E-cadherin蛋白在12周時表達下降不明顯，在24周和28周時明顯下降，α-SMA、Vimentin蛋白在一直維持在較高水平（P ＜0.05，圖2）。

圖2 Western blot 檢測小鼠腎組織E-cadherin、α-SMA 和Vimentin 蛋白水平Fig.2 Detection of E-cadherin，α-SMA and Vimentin protein expression in renal tissue of mouse by Western blot

圖1 HE 和Masson 染色示各組小鼠腎組織形態(tài)學變化（400×）Fig.1 Histological change of kidney tissue in each groups by HE and Masson staining（400×）

2.4 各組小鼠腎組織中SMYD2、TGF-β1 蛋白表達變化與NC組小鼠相比，DM組SMYD2蛋白表達逐漸增加（P ＜0.05）；TGF-β1在NC組有少量表達，DM組從24周開始可見TGF-β1蛋白表達明顯增加（P ＜0.05，圖3）。

圖3 Western blot 檢測小鼠腎組織SMYD2、TGF-β1 蛋白水平Fig.3 Detection of SMYD2、TGF-β1 protein expression inrenal tissue of mouse by Western blot

2.5 相關性分析SMYD2與E-cadherin的蛋白表達量呈負相關（r =-0.846），與α-SMA、Vimentin和TGF-β1的蛋白表達量呈正相關（r = 0.601，P ＜0.05；r=0.608，P ＜0.05，r=0.769，P ＜0.05）。

3 討論

有研究［14］表明腎小管上皮細胞EMT在DN腎臟纖維化中扮演了重要的角色，其特點是上皮表面標志物的丟失，間充質(zhì)標志物的獲得和細胞骨架重塑。除此之外，眾多研究者發(fā)現(xiàn)應用多種藥物或細胞因子抑制腎小管上皮細胞EMT能有效減輕DN腎臟纖維化［15-18］。這些研究背景表明了EMT在DN腎臟纖維化中占據(jù)重要地位。在本實驗研究中，HE染色結果顯示DM小鼠在24周和28周時腎臟病理學改變較為明顯，Masson染色結果顯示DM小鼠在24周和28周時腎間質(zhì)有纖維沉積，并且上皮表面標志物E-cadherin蛋白表達明顯下降，間充質(zhì)標志物α-SMA、Vimentin蛋白表達明顯增加，表明小鼠發(fā)生了EMT。TGF-β1主要通過激活Smad信號通路誘導EMT的發(fā)生［19-21］，同時也可激活其它非Smad信號通路來發(fā)揮生物學效應。本研究發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，DM小鼠腎組織TGF-β1蛋白水平表達明顯增加。

越來越多的研究表明，組蛋白甲基化在腎臟疾病中發(fā)揮了重要的作用。LIU等［22］研究結果顯示，在單側輸尿管梗阻（UUO）誘導腎臟纖維化小鼠模型和TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞和成纖維細胞中，組蛋白甲基轉移酶DOT1L表達增加，H3K79me2水平增加，給予高選擇性的DOT1L抑制劑EPZ5676干預可以緩解小鼠腎臟纖維化、腎小管上皮細胞發(fā)生EMT和肌成纖維細胞活化。SASAKI等［23］研究顯示，在UUO小鼠中，TGF-β1通過Smad3途徑誘導組蛋白甲基轉移酶SET7/9表達上調(diào)，應用siRNA SET7/9和其抑制劑sinefungin干預后能改善UUO小鼠的腎臟纖維化。ZHOU等［24］研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白甲基轉移酶Zeste homolog-2（EZH2）和H3K27me3在UUO小鼠腎組織和TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞中高表達，用EZH2抑制劑3-deazaneplanocin A和siRNA EZH2干預后可以減輕小鼠腎臟纖維化和腎小管上皮細胞發(fā)生EMT。因此組蛋白甲基化在腎臟纖維化中占據(jù)重要地位。本研究發(fā)現(xiàn)SMYD2在鏈脲佐菌素誘導的DM小鼠腎組織中高表達，DM28周時蛋白水平增加尤為明顯。相關性分析結果顯示，SMYD2與E-cadherin呈明顯負相關，與α-SMA和Vimentin呈明顯正相關，以上結果足以說明SMYD2是DM小鼠腎臟發(fā)生EMT的關鍵分子，且SMYD2與TGF-β1的蛋白表達呈明顯正相關，提示本模型中SMYD2高表達可能與TGF-β1有重要聯(lián)系，但具體作用機制有待進一步研究。

綜上所述，在鏈脲佐菌素誘導DM小鼠模型中，腎組織SMYD2表達上調(diào)，推測其可能和TGF-β1表達上調(diào)共同參與EMT的發(fā)生，進而參與調(diào)控DN的發(fā)生發(fā)展。然而在DN的發(fā)展過程中，SMYD2和TGF-β1之間到底有何聯(lián)系以及其表達的上調(diào)還受哪些因素的影響有待進一步研究證實。