柳丹，李珊，趙紅艷，柯鏡，湯志明，白磊，牛成群，牟雪瑤，朱明明，武福云

（湖北醫(yī)藥學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，湖北 十堰 442000）

我國惡性腫瘤的死亡率居高不下，腫瘤耐藥現(xiàn)象最早在上世紀(jì)40年代被發(fā)現(xiàn)。腫瘤細(xì)胞接觸一種化療藥物后很快會產(chǎn)生耐藥，且同時(shí)對多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥，其稱為腫瘤的多藥耐藥性[1]。腫瘤細(xì)胞多藥耐藥是臨床化療藥物效果欠佳的主要原因，其導(dǎo)致腫瘤的惡化和轉(zhuǎn)移。大量研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥分子機(jī)制涉及多個進(jìn)程（如藥物攝取減少、外排增加、改變藥物代謝、增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)及抗凋亡的產(chǎn)生等），但其具體機(jī)制到目前為止還不清楚。P-糖蛋白是由多藥耐藥基因（multidrug resistance 1 gene,MDR1）編碼，在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)（如腎癌、結(jié)腸癌和腎上腺腫瘤等[2]）。多種化療藥物可通過結(jié)合P-糖蛋白的不同位點(diǎn)而被排出細(xì)胞外，從而產(chǎn)生耐藥[3]。除P-糖蛋白外還有2個主要的耐藥蛋白：腫瘤多藥耐藥相關(guān)蛋白1（multidrug resistance-associated protein 1,MRP1）和乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein,BCRP/ABCG2）[4]。因此闡明多藥耐藥基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，控制多藥耐藥基因的表達(dá)將有助于逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥。

1 多藥耐藥基因MDR1的表達(dá)調(diào)控

MDR1是最早鑒定的多藥耐藥基因，其編碼的蛋白P-糖蛋白包含1 280個氨基酸，分子量170～180 kD。其在多種正常組織中表達(dá)，發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)及分泌的功能，從而保護(hù)正常組織細(xì)胞免受細(xì)胞毒素及外源性有毒物質(zhì)的影響[5]。同時(shí)P-糖蛋白作為化療藥物的排出泵直接參與腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥，其表達(dá)水平的高低直接與腫瘤耐藥相關(guān)。但MDR1的調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，其在轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平都受到多方面的調(diào)控。

1.1 MDR1基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控

MDR1基因的啟動子區(qū)域含有多個轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，能與多個轉(zhuǎn)錄因子及阻遏蛋白結(jié)合，從而發(fā)揮正調(diào)控及負(fù)調(diào)控的作用[6]。轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor-Y,NF-Y）能與MDR1啟動子區(qū)域的Y盒元件（反向CCAAT序列）結(jié)合，促進(jìn)MDR1基因的轉(zhuǎn)錄。MDR1啟動子富含GC的區(qū)域GC盒能夠與轉(zhuǎn)錄因子SP1（specificity protein 1,SP1）結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄。而且這2個區(qū)域相鄰，NF-Y與SP1也存在直接的相互作用，兩者共同來調(diào)節(jié)MDR1的轉(zhuǎn)錄[7]。MDR1的啟動子區(qū)域含有2個轉(zhuǎn)錄因子AP1（activator protein 1,AP1）的結(jié)合位點(diǎn)，AP1可能通過與其他蛋白（如C-JUN、CFOS等調(diào)節(jié)因子相互作用），在不同的腫瘤耐藥細(xì)胞發(fā)揮促進(jìn)或抑制轉(zhuǎn)錄的功能（例如在長春新堿耐藥的SGC7901胃癌細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄因子AP1促進(jìn)MDR1的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)耐藥，而在肺癌細(xì)胞H460及卵巢癌細(xì)胞SKOV3，過表達(dá)AP1則會抑制MDR1的轉(zhuǎn)錄[8]）。另外1個重要的MDR1轉(zhuǎn)錄因子是P53，野生型P53蛋白能負(fù)調(diào)控MDR1的表達(dá)，而突變型P53由于失去功能，表現(xiàn)出的則是激活作用[9]。NF-κB/P65和c-Fos形成復(fù)合體與啟動子區(qū)域的CAAT元件結(jié)合負(fù)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[10]。除此之外，其他的一些調(diào)控MDR1的轉(zhuǎn)錄因子也被鑒定[如叉頭轉(zhuǎn)錄因子（fork head transcription factors,FOXO1）、增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（CCAAT-enhancer binding proteins,C/EBP）和核因子NF-R1等]，他們分別可以結(jié)合啟動子區(qū)域的不同位點(diǎn)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。除轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，MDR1的轉(zhuǎn)錄水平還被可以被一些誘導(dǎo)因素調(diào)節(jié)（如熱休克、X射線和一些化療藥物等[11]）。

MDR1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)非常復(fù)雜，因?yàn)閱幼訁^(qū)域有多個發(fā)揮調(diào)控作用的元件，而且很多元件相互重疊，因此不同的轉(zhuǎn)錄因子可能需要競爭性地發(fā)揮功能。同時(shí)一些轉(zhuǎn)錄因子又需要與其他蛋白相互作用，協(xié)同性地發(fā)揮調(diào)控作用。有研究表明，E2F1通過調(diào)控ATP結(jié)構(gòu)域運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白促進(jìn)MDR1的啟動子活性，使P-糖蛋白的表達(dá)量增加，導(dǎo)致腫瘤多藥耐藥的發(fā)生[12]。透明質(zhì)酸（hyaluronan,HA）是大多數(shù)哺乳動物組織細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分[13]。CD44是一種在多種正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞和癌組織中表達(dá)的跨膜糖蛋白，有研究結(jié)果顯示在乳腺癌細(xì)胞中HA和CD44結(jié)合將刺激MDR1轉(zhuǎn)錄激活，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥發(fā)生[14]。

1.2 MDR1翻譯水平（P-糖蛋白）的調(diào)節(jié)

P-糖蛋白在翻譯及翻譯后水平也受到多種機(jī)制的調(diào)控，多條信號通路與P-糖蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。而且P-糖蛋白功能的發(fā)揮還受到磷酸化、糖基化及泛素化等的調(diào)節(jié)。

研究表明，絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases,MAPK）信號通路能夠正調(diào)節(jié)或者負(fù)調(diào)節(jié)P-糖蛋白的表達(dá)（包括ERK通路、p38 MAPK通路和JNK通路）；ERK信號通路參與多種細(xì)胞的生理功能（包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡等）；抑制ERK信號通路能下調(diào)P-糖蛋白的表達(dá)；p38 MAPK信號通路在不同的腫瘤耐藥細(xì)胞發(fā)揮不同的作用，正調(diào)控或負(fù)調(diào)控P-糖蛋白的表達(dá)水平。5-氟尿嘧啶耐藥的肝癌細(xì)胞BEL-7402/5-FU，活化p38MAPK信號通路能減少M(fèi)DR1的表達(dá)。而在長春新堿耐藥的胃癌細(xì)胞SGC7901/VCR，抑制p38MAPK能減少M(fèi)DR1的表達(dá)[15]。

P-糖蛋白還是蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）和蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）磷酸化的底物，磷酸化對于P-糖蛋白自身的轉(zhuǎn)運(yùn)和功能非常重要。P-糖蛋白多個絲氨酸位點(diǎn)可以被PKA和PKC磷酸化（如絲氨酸第661，667和671位點(diǎn)等）。PKA磷酸化MDR1促進(jìn)其向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，PKC活化能夠增加腫瘤耐藥細(xì)胞內(nèi)MDR1的磷酸化水平，從而減少藥物在細(xì)胞內(nèi)的積累[16-17]。

1.3 微小RNA調(diào)控MDR1的表達(dá)水平

微小RNA（micro RNAs,miRNA）是一種單鏈非編碼RNA，可以通過雜交互補(bǔ)的信使RNA調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。很多研究表明，多種miRNA均能夠通過MDR1參與腫瘤耐藥（如miRNA-451、miRNA-27a、miRNA-145和miRNA-298等），能夠直接結(jié)合MDR1 mRNA的3'-UTR區(qū)域，抑制P-糖蛋白的表達(dá)，從而增加化療藥物的敏感性。而另外一些miRNA（如miRNA-137、miRNA-122和miRNA-138）能夠通過作用于其他蛋白，間接地減少M(fèi)DR1的mRNA水平。相反有些miRNAs能促進(jìn)MDR1的轉(zhuǎn)錄（如miRNA-19a/b的表達(dá)能夠增加MDR1 mRNA及蛋白水平），促進(jìn)胃癌細(xì)胞阿霉素耐藥[18]。miRNA-503-5p的表達(dá)量增加后可使腫瘤細(xì)胞凋亡減少，MDR1的表達(dá)量增加，低表達(dá)miRNA-503-5p后腫瘤細(xì)胞對奧沙利鉑的敏感性增加，MDR1的表達(dá)量也隨之減少。還有研究表明，miRNA-21過表達(dá)將導(dǎo)致MDR1/P-糖蛋白的表達(dá)量增加，腫瘤細(xì)胞增殖增加。相反，降低miRNA-21將導(dǎo)致增殖相關(guān)的基因及MDR1/P-糖蛋白的表達(dá)量都會減少[19]。

總之，MDR1的表達(dá)水平直接與腫瘤細(xì)胞多藥耐藥相關(guān)，利用MDR1的抑制劑抑制其外排化療藥物的功能或者通過抑制相關(guān)信號通路從而調(diào)控MDR1的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，對逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥有一定的效果。

2 細(xì)胞自噬與腫瘤細(xì)胞耐藥

細(xì)胞自噬是細(xì)胞發(fā)生的一種自我消化，是細(xì)胞在缺乏能量，饑餓，低氧，生長因子缺乏等各種壓力刺激下發(fā)生的一種促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)代謝廢物發(fā)生降解的一種反應(yīng)，是真核細(xì)胞通過自我消化吞噬后維持生存的一種生物學(xué)行為。自噬的發(fā)生主要通過自噬相關(guān)基因、自噬相關(guān)蛋白、自噬相關(guān)細(xì)胞膜分子、自噬相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)。自噬的發(fā)生和發(fā)展和多種疾病都有聯(lián)系，包括炎癥，腫瘤和耐藥[20]。

2.1 保護(hù)性自噬促進(jìn)腫瘤細(xì)胞耐藥

自噬和腫瘤的關(guān)系極為密切，自噬可以通過不同的作用機(jī)制發(fā)揮不同的功能：一方面在正常細(xì)胞中自噬可以抑制正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞；另一方面在腫瘤細(xì)胞中自噬可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞，當(dāng)腫瘤細(xì)胞在饑餓缺氧等不利于存活的條件下就可以激活自噬獲得營養(yǎng)物質(zhì)和能力，促使腫瘤細(xì)胞抵抗化療藥物引起的凋亡等而長期存活。近年來越來越多的證據(jù)都表明自噬和耐藥基因的表達(dá)密切相關(guān)[21]。自噬可能是引起腫瘤細(xì)胞耐藥的一種新的重要機(jī)制[22]，研究證明自噬誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥的機(jī)制可能有兩種：腫瘤細(xì)胞可以利用溶酶體消化降解細(xì)胞內(nèi)的有功能障礙的細(xì)胞器及各種生物大分子，回收利用各種原料，使細(xì)胞免于凋亡和死亡，為細(xì)胞的生存提供重要保障；自噬是通過某種方式緩解細(xì)胞內(nèi)部壓力，降解有害物質(zhì)，使細(xì)胞能迅速適應(yīng)新環(huán)境，保證細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及生存。

研究發(fā)現(xiàn)，自噬導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥主要依賴自噬信號通路及自噬相關(guān)基因的調(diào)節(jié)，目前其信號通路研究最多的是依賴mTOR的信號通路和非依賴mTOR的信號通路。mTOR信號通路是調(diào)節(jié)自噬的主要途徑，通常mTOR能抑制自噬的發(fā)生，mTOR主要是由mTORC1和mOTRC2兩種蛋白復(fù)合體形成，mTORC1是調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。主要通過PI3K/AKT/mTOR途徑發(fā)揮調(diào)控作用。進(jìn)一步的研究表明，使用mTOR抑制劑Rapamycin可以阻斷mTOR信號通路來誘導(dǎo)自噬保護(hù)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生耐藥[23]。自噬激活使細(xì)胞內(nèi)MDR1的表達(dá)量發(fā)生改變，在腫瘤細(xì)胞中Beclin1，LC3和MDR1的表達(dá)量成正比，在預(yù)后差的患者體內(nèi)也檢測到自噬水平的升高。YANG等[24]證明化療藥物-阿霉素和長春新堿可以通過Beclin1-Ⅲ類磷脂酰肌醇激酶3復(fù)合體（PI3K-Ⅲ/class Ⅲ phosphatidylinositol 3-kinase,PI3KC3）的形成提高S100鈣結(jié)合蛋白A8的表達(dá)量。而S100A8通過調(diào)節(jié)自噬引起MDR1的表達(dá)量改變[25]。高遷移率族蛋白1（high-mobility group protein 1,HMGB1）也能通過從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)促進(jìn)Beclin1-PI3 KC3復(fù)合體形成來誘導(dǎo)自噬，進(jìn)而介導(dǎo)MDR1的表達(dá)使腫瘤細(xì)胞耐藥[26]。

miRNAs也能夠通過自噬調(diào)節(jié)MDR1的表達(dá)，XUE等證明在以順鉑為基礎(chǔ)的治療中，miRNA-199a-5p的表達(dá)量下調(diào)能夠激活自噬并使MDR1的表達(dá)量增加[27]；而在胃癌耐藥細(xì)胞SCG7901/DDP中，miRNA-181a能夠抑制自噬，提高腫瘤細(xì)胞對順鉑的毒性反應(yīng)，使細(xì)胞凋亡增加[28]。因此自噬抑制劑的使用有助于增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。同樣，通過沉默自噬相關(guān)基因Beclin1、Atg5、Atg7及Atg12的表達(dá)降低自噬的發(fā)生可以有效控制腫瘤細(xì)胞耐藥。例如在7901/DDP細(xì)胞中通過過表達(dá)的miRNA-23b-3p可以調(diào)控Atg12和HMG2的表達(dá)增強(qiáng)耐藥腫瘤細(xì)胞對順鉑等化療藥的敏感性。而在7901細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)染小干擾RNA（siRNAs）靶定Atg12和HMGB2使腫瘤細(xì)胞自噬增強(qiáng)，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞對化療藥產(chǎn)生耐藥性。在各種耐藥的腫瘤細(xì)胞中都可以檢測到MDR的表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞可能通過發(fā)生保護(hù)性自噬并對化療藥物產(chǎn)生抵抗[29]；一方面，增強(qiáng)自噬能保護(hù)耐藥細(xì)胞減少凋亡的發(fā)生，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的耐藥性；另一方面，抑制自噬可增強(qiáng)耐藥細(xì)胞對抗癌藥的敏感性。

2.2 過度自噬抑制腫瘤細(xì)胞耐藥

一些研究證實(shí)，自噬和腫瘤細(xì)胞化療耐藥密切相關(guān)，是腫瘤耐藥細(xì)胞的一部分。過度自噬在腫瘤耐藥中起著抑制的作用。該學(xué)說認(rèn)為，細(xì)胞如果過度自噬會引起自噬性死亡，通過過度誘導(dǎo)自噬能有效殺死腫瘤耐藥細(xì)胞。通過自噬逆轉(zhuǎn)耐藥已經(jīng)成為研究癌細(xì)胞耐藥的另一個方面。異羥肟酸（SANA）是一種新開發(fā)的組蛋白去乙?；敢种苿谌橄侔┠退幖?xì)胞株中能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡并能有效抑制腫瘤細(xì)胞生長[30]。隱丹參酮和二氫丹參酮是兩種脂溶性丹參酮，也能通過誘導(dǎo)自噬性死亡抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖[31]。非衍生富勒烯C60團(tuán)簇（nano-C60）在多種腫瘤細(xì)胞中都具有抗癌作用，nano-C60活化后能引起氧化應(yīng)激誘導(dǎo)自噬發(fā)生，通過nano-C60誘導(dǎo)的自噬在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中能提高化療藥物的敏感性[32]。本結(jié)果表明，自噬性死亡可以誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞發(fā)生死亡，改善腫瘤細(xì)胞耐藥。盡管該分子機(jī)制到目前為止還不能確定，但該結(jié)果都表明自噬和耐藥的相關(guān)性。

綜上所述，自噬在腫瘤耐藥中能產(chǎn)生持久的作用，自噬促進(jìn)細(xì)胞生存還是死亡依賴于腫瘤細(xì)胞的類型和不同的耐藥性。在一些耐藥的腫瘤細(xì)胞中可以檢測到凋亡基因表達(dá)量減少，而在該情況下適應(yīng)性自噬可以增加耐藥細(xì)胞的耐藥性；但在某些特定情況下，過度的自噬可以清除一些抗凋亡信號通路，反而增加耐藥細(xì)胞對藥物化療的敏感性。通過調(diào)控MDR1的表達(dá)水平減少化療藥物的外排，以及利用腫瘤細(xì)胞自噬增加化療藥物的敏感性，將有可能為治療腫瘤耐藥帶來新的希望。