竇全偉 李吉濤, 劉 萍, 李 健, 劉九美孫東方 蔡 影 環(huán)朋朋

(1. 大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 大連 116023; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青島 266071; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室, 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室, 青島 266235)

脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)又名小白蝦、五須蝦、迎春蝦等, 隸屬甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、長臂蝦科(Palaemonidae)、白蝦屬(Exopalaemon), 系熱溫帶海區(qū)底棲蝦類, 分布于中國大陸沿岸和朝鮮半島西岸的淺海低鹽水域,以黃渤海產(chǎn)量最高, 具有繁殖周期長、生長速度快、環(huán)境適應(yīng)性廣、食性雜、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)[1,2],成為沿海灘涂地區(qū)重要的特色水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。

近20年來, 隨著池塘養(yǎng)殖規(guī)模的迅速擴(kuò)大, 脊尾白蝦顯示出明顯的養(yǎng)殖前景, 然而細(xì)菌及病毒疾病的爆發(fā)給蝦類養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失, 針對蝦類非特異性免疫防御機(jī)制的研究正在廣泛開展[3]。研究表明, 血藍(lán)蛋白不僅具有輸氧功能, 而且還具有酚氧化物酶活性[4]、抗病毒活性[5]、凝集活性[6]和抑菌活性[7]等多種免疫學(xué)功能, 被認(rèn)為是一種具有多種非特異性免疫活性的多功能蛋白。目前, 隨著對甲殼動(dòng)物血藍(lán)蛋白功能的深入研究, 其cDNA序列已相繼被克隆[8—10]。研究表明凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)具有大小兩個(gè)血藍(lán)蛋白亞基[11],且感染哈維氏弧菌后的血藍(lán)蛋白mRNA的表達(dá)量呈上調(diào)趨勢[12]。脊尾白蝦血藍(lán)蛋白基因小亞基的克隆工作已經(jīng)完成[10], 而大亞基的研究未見報(bào)道。本研究通過RACE技術(shù)(Rapid Amplification of cDNA Ends)克隆了脊尾白蝦血藍(lán)蛋白大亞基基因的cDNA全長, 并分析了金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌及白斑綜合征病毒(WSSV)感染后該基因的表達(dá)變化, 為進(jìn)一步深入了解血藍(lán)蛋白基因在免疫防御中作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

取體長(4.5±0.25) cm、(2.19±0.42) g的健康脊尾白蝦, 飼養(yǎng)于200 L的PVC桶中, 暫養(yǎng)7d進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)期為3d。選取暫養(yǎng)的健康脊尾白蝦1200尾(每桶100尾)分為4個(gè)組, 設(shè)金黃色葡萄球菌感染組、副溶血弧菌感染組、WSSV感染組和對照組, 每組3個(gè)平行, 分別進(jìn)行細(xì)菌感染和病毒感染實(shí)驗(yàn)。

菌懸液的制備配制2216E (液體成分: 蛋白胨母膏, 磷酸高鐵; 固體成分加瓊脂粉)和胰蛋白大豆肉湯(TSB)液體及固體培養(yǎng)基, 滅菌備用。將副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)菌種(本實(shí)驗(yàn)室保存)接種于2216E液體培養(yǎng)基中, 28℃培養(yǎng)過夜。于2216E固體培養(yǎng)基上劃線純化1次; 選取單菌落接種于2216E液體培養(yǎng)基中, 28℃ 200 r/min搖床上培養(yǎng)8—10h, 使活菌數(shù)在108CFU/mL左右。將菌懸液離心, 棄上清液, 用生理鹽水對菌體進(jìn)行反復(fù)洗滌,重懸后, 使菌體的濃度達(dá)108CFU/mL。

將金黃色葡萄球菌(Stphylococcus aureus)(本實(shí)驗(yàn)室保存)接種于TSB液體培養(yǎng)基中, 37℃培養(yǎng)過夜。于TSB固體培養(yǎng)基上劃線純化1次; 選取單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中, 37℃ 180 r/min搖床上培養(yǎng)12h, 使活菌數(shù)在108CFU/mL左右。將菌懸液離心, 棄上清液, 用生理鹽水對菌體進(jìn)行反復(fù)洗滌,重懸后, 使菌體的濃度達(dá)108CFU/mL。

WSSV 粗提液的制備取感染W(wǎng)SSV的脊尾白蝦病蝦(本實(shí)驗(yàn)室保存) 頭尖組織5 g, 加入適量(800 μL) 4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(1×PBS), 20000 r/min冰浴勻漿, 將獲得的勻漿液于4℃ 3000 r/min離心15min, 取上清液反復(fù)離心3次(4000、6000、8000 r/min各15min), 將所得的上清液用0.45 μm濾膜過濾除菌, 將除菌的粗提液稀釋100倍(3.7×107copy/mL)進(jìn)行分裝并保存于 -80℃冰箱中備用。

實(shí)驗(yàn)時(shí)將菌懸液、WSSV粗提液用微量注射器從脊尾白蝦的第2腹節(jié)處注入(20 μL/尾)。對照組注射pH為7.4的1×PBS緩沖液(20 μL/尾)。在注射后的6h、12h、24h、48h、72h取樣, 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取5尾蝦, 取血液、肝胰腺、鰓、肌肉等組織, 用于總RNA提取。

1.2 脊尾白蝦總RNA提取及cDNA合成

脊尾白蝦組織總RNA提取利用TRIzol試劑(Invitrogen公司), 用核酸定量儀(Thermo, NanoDrop 2000)和1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量及完整性。使用DNaseⅠ RNase-free (Fermentas)試劑盒去除提取的總RNA中殘留的DNA。

cDNA合成體系(20 μL): 10 μL總RNA, 2 μL Oligo dT (50 μmol/L), 72℃水浴5min, 冰浴2min, 瞬時(shí)離心數(shù)秒使溶液聚集于管底; 之后再向管中加入1.0 μL dNTP Mixture (each 10 mmol/L)、5×M-MLV Buffer 4.0 μL、0.5 μL RNase Inhibitor (40 μL/mL,TaKaRa)和1.0 μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa), 用DEPC水補(bǔ)足體積; PCR儀上42℃孵育lh; 72℃孵育15min; 4℃孵育20min。合成的cDNA用于后期脊尾白蝦血藍(lán)蛋白基因的克隆及Real-time PCR檢測。脊尾白蝦3′和5′RACE模板的合成根據(jù)SMARTTM RACE Amplification Kit說明書進(jìn)行。

1.3 脊尾白蝦血藍(lán)蛋白大亞基基因cDNA中間片段克隆

根據(jù)從GenBank獲得的凡納濱對蝦血藍(lán)蛋白基因(AJ250830.1)、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)血藍(lán)蛋白基因(AF4317371)、日本沼蝦(Macrobrachium mipponensis)血藍(lán)蛋白基因(KF431830)序列設(shè)計(jì)簡并引物HcL-F和HcL-R (上海生工生物工程有限公司合成)(表 1)。PCR反應(yīng)體系(20 μL): TransTaq?HiFi Polymerase (5 U/μL) 0.2 μL, 10×TransTaqHiFi Buffer Ⅱ 2 μL, 2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL, HcLF 1 μL, HcLR 1 μL, 脊尾白蝦cDNA模板2 μL, ddH2O 12.2 μL。反應(yīng)程序: 94℃ 5min; 94℃ 30s, 58℃ 30s,72℃ 30s, 35個(gè)循環(huán); 72℃ 10min; 4℃保存。1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 用DNA膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)純化PCR擴(kuò)增特異性產(chǎn)物,連接到pMD18-T (TaKaRa)載體上, 重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞(北京天根生化科技有限公司)中, 挑取陽性克隆子進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證后測序。

表 1 本研究所用引物序列Tab. 1 Primers used in this study

1.4 脊尾白蝦血藍(lán)蛋白大亞基cDNA 5′和3′末端的擴(kuò)增

根據(jù)測序得到的中間序列設(shè)計(jì)5′ RACE引物(5HcL-1、5HcL-2)和3′ RACE引物(3HcL-1、3HcL-2)(表 1)擴(kuò)增脊尾白蝦大亞基血藍(lán)蛋白基因cDNA全長序列。按照SMARTTMcDNA Amplification Kit(Clontech)說明書推薦的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行5′ RACE和3′ RACE擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化、克隆及測序同上所述。

1.5 序列分析

將測序結(jié)果去載體后, 采用ContigExpress進(jìn)行5′和3′序列拼接, 用NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.gov/Blast.cgi)網(wǎng)頁進(jìn)行序列比對及結(jié)構(gòu)域預(yù)測,用SignalP 4.0軟件分析信號肽, 采用DNAMAN軟件進(jìn)行不同來源的血藍(lán)蛋白的氨基酸序列多序列比對, 用MEGA 6.0軟件[13]中的Neighbor-joining法[14]構(gòu)建系統(tǒng)樹。

1.6 EcHcL基因組織分布特征分析

根據(jù)脊尾白蝦血藍(lán)蛋白EcHcL基因設(shè)計(jì)正反向引物(QEcHcL-F/R)(表 1), 用于Real-time PCR檢測。按照前述選擇6尾健康的脊尾白蝦, 取其鰓、卵巢、肝胰腺、心臟、腸、肌肉、胃、腹神經(jīng)節(jié)、眼柄、血細(xì)胞用于各組織RNA的提取及cDNA的合成。利用Real-time PCR檢測不同組織中EcHcL基因的分布情況。使用SYBR Premix ExTaqⅡ 試劑(TaKaRa), Applied Biosystems 7500 Real Time PCR儀上進(jìn)行, 反應(yīng)體系為10 μL: 5 μL SYBR Premix ExTaqⅡ、1 μL cDNA、0.4 μL正反向引物、0.2 μL ROX Reference dye Ⅱ 及3 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 10min; 95℃ 30s, 95℃ 5s, 60℃ 34s,40個(gè)循環(huán); 95℃ 15s; 60℃ 1min; 95℃ 15s。以βactin基因作為內(nèi)參基因, 樣本和內(nèi)參均設(shè)置3個(gè)平行, 采用2-ΔΔCt方法[15]計(jì)算EcHcL基因的相對表達(dá)量。

圖1 脊尾白蝦EcHcL血藍(lán)蛋白結(jié)構(gòu)域位置Fig. 1 Three domains of EcHcL hemocyanin

1.7 副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌感染脊尾白蝦后血藍(lán)蛋白基因EcHcL的表達(dá)分析

分別提取副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌感染后不同時(shí)間脊尾白蝦的肝胰腺和血細(xì)胞組織的RNA, 按照前述方法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA進(jìn)行Realtime PCR, 以β-actin基因作為內(nèi)參基因, 樣本和內(nèi)參均設(shè)置3個(gè)平行, 檢測細(xì)菌感染下的脊尾白蝦血細(xì)胞和肝胰腺中EcHcL基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況。反應(yīng)體系、反應(yīng)程序及數(shù)據(jù)分析如1.6所述。

1.8 白斑綜合征病毒感染后脊尾白蝦EcHcL的表達(dá)分析

提取WSSV感染后不同時(shí)間脊尾白蝦血細(xì)胞和肝胰腺組織的RNA, 按照前述方法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA進(jìn)行Real-time PCR。反應(yīng)體系、反應(yīng)程序及數(shù)據(jù)處理同如1.6所述。

2 結(jié)果

2.1 脊尾白蝦血藍(lán)蛋白大亞基因cDNA全長的克隆及序列分析

采用RACE方法和RT-PCR擴(kuò)增獲得脊尾白蝦血藍(lán)蛋白大亞基基因cDNA全長, 命名為EcHcL(GenBank登錄號: MFID143190)。EcHcL序列分析顯示全長2192 bp, 包括2034 bp的開放閱讀框(ORF)、5′端非編碼區(qū)(UTP) 21 bp和137 bp的3′非編碼區(qū), 其中包括1個(gè)終止子TAG和多聚腺苷酸PolyA尾(加尾信號AATAAA)。氨基酸序列分析顯示,EcHcL編碼677個(gè)氨基酸, 預(yù)測分子量為78.5 kD,理論等電點(diǎn)(PI)為5.41。Signal P 4.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析顯示此氨基酸序列N端前21個(gè)氨基酸組成信號肽。SMART(Simple Modular Architecture Research Tool)軟件分析表明, 脊尾白蝦EcHcL血藍(lán)蛋白含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域:Hemocyanin_N (25-147aa)、Hemocyanin_M (154-411aa)、Hemocyanin_C (420-668aa)(圖1)。Hemoeyanin-M結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn)含6個(gè)保守的組氨酸殘基H218、H222、H249、H372、H376、H414。

2.2 EcHcL氨基酸序列比對同源性分析

使用NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 對脊尾白蝦EcHcL基因編碼的氨基酸序列與其他物種的血藍(lán)蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性比較, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)同源性最高達(dá)到87%, 與凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)、日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)同源性分別為73%、72%、71%, 與疣酋婦蟹(Eriphia verrucosa)、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)、斑點(diǎn)海虱(Eurydice pulchra)的同源性分別為68%、67%、63%。將多個(gè)物種的血藍(lán)蛋白Hemocyanin_M結(jié)構(gòu)域比對發(fā)現(xiàn), 這些氨基酸序列都相對保守, 同源性達(dá)到90.97%, 并且均含有兩個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn)。

2.3 EcHcL氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 6.0軟件對脊尾白蝦EcHcL基因氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析, 并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。結(jié)果顯示17個(gè)物種中, 脊尾白蝦EcHcL與日本沼蝦、大和米蝦(Caridina multidentata)血藍(lán)蛋白、日本囊對蝦、斑節(jié)對蝦、凡納濱對蝦、中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)等動(dòng)物的血藍(lán)蛋白為一個(gè)亞群。與中華絨螯蟹、疣酋婦蟹、珍寶蟹(Metacarcinus magister)、藍(lán)蟹(Callinectes sapidus)、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)為另一個(gè)亞群。EcHcL在進(jìn)化上與日本沼蝦的親緣關(guān)系最近, 與信號小龍蝦(Pacifastacus leniusculus)、斑點(diǎn)海虱、蛀木水虱(Limnoria quadripunctata)、鉤蝦(Gammarus roeselii)、木紋網(wǎng)球蝦(Atyopsis moluccensis)、蟬形齒指蝦蛄(Odontodactylus scyllarus)等動(dòng)物的血藍(lán)蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 EcHcL基因在不同組織中的表達(dá)分析

利用RT-PCR分析EcHcL基因在不同組織中的表達(dá)水平, 結(jié)果顯示,EcHcL基因在脊尾白蝦鰓、卵巢、肝胰腺、心臟、腸、肌肉、胃、腹神經(jīng)節(jié)、眼柄、血細(xì)胞中均有表達(dá), 其中, 肝胰腺中表達(dá)量最高, 其次為血細(xì)胞, 在腹神經(jīng)節(jié)、心臟、腸、鰓、卵巢、肌肉、胃、眼柄中表達(dá)量較低(圖3)。

圖2 MEGA 6.0軟件構(gòu)建的基于EcHcL氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 NJ phylogenetic tree based on EcHcL amino acid sequence by MEGA 6.0

2.5 感染后EcHcL基因在肝胰腺及血細(xì)胞中的表達(dá)分析

如圖4所示, 脊尾白蝦感染金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、WSSV后, 脊尾白蝦肝胰腺中EcH-cL基因表現(xiàn)出一定的時(shí)間依賴性, 總體趨勢表現(xiàn)為先升高后降低。EcHcL表達(dá)量在金黃色葡萄球菌感染后48h達(dá)到峰值, 與對照組有顯著性差異(P＜0.05), 到72h下降到與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。EcHcL表達(dá)量在副溶血弧菌感染后12h達(dá)到峰值,與對照組差異極顯著(P＜0.01), 24h后表達(dá)量持續(xù)下降, 到72h下降到與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。感染W(wǎng)SSV后,EcHcL在肝胰腺內(nèi)表達(dá)量在12h達(dá)到最大值, 并與對照組差異極顯著(P＜0.01)。如圖5所示, 感染金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、WSSV后,脊尾白蝦血細(xì)胞中血藍(lán)蛋白EcHcL基因表達(dá)量表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢, 均在24h達(dá)到峰值, 并且金黃色葡萄球菌感染組和WSSV感染組與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05), 副溶血弧菌感染組與對照組相比差異極顯著(P＜0.01)。

3 討論

3.1 EcHcL基因cDNA全長的克隆及序列分析

血藍(lán)蛋白是位于甲殼動(dòng)物血淋巴中的含銅呼吸蛋白, 它通過與氧氣的可逆結(jié)合滿足集體的氧需求, 結(jié)合氧狀態(tài)與銅結(jié)合為藍(lán)色, 脫氧狀態(tài)與銅脫離為無色。本實(shí)驗(yàn)成功克隆了脊尾白蝦血藍(lán)蛋白大亞基基因, 預(yù)測編碼蛋白分子量為78.5 kD, 與已分離的日本沼蝦、凡納濱對蝦血藍(lán)蛋白大亞基分子量類似[11,16]。研究表明, 典型的甲殼動(dòng)物血藍(lán)蛋白是由氨基酸數(shù)為630—660、分子量為70—80 kD的異源亞基構(gòu)成的六聚體, 六聚體中每個(gè)亞基折疊為三個(gè)結(jié)構(gòu)域, 其中第一、三結(jié)構(gòu)域分別為亞基蛋白的N、C端, 第二結(jié)構(gòu)域含血藍(lán)蛋白的活性部位,活性部位結(jié)合有兩個(gè)銅離子, 每個(gè)銅離子分別與蛋白質(zhì)鏈上三個(gè)組氨酸結(jié)合[17]。在本實(shí)驗(yàn)中, SMART結(jié)果顯示, 脊尾白蝦血藍(lán)蛋白大亞基含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域: Hemocyanin_N (25—147aa)、Hemocyanin_M(154—411aa)、Hemocyanin_C (420—668aa) 和Hemoeyanin-M結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn)含6個(gè)保守的組氨酸殘基H218、H222、H249、H372、H376和H414。氨基酸序列比對結(jié)果顯示, 銅離子結(jié)合區(qū)相似性較高, 說明該血藍(lán)蛋白銅結(jié)合區(qū)在進(jìn)化上相對保守。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示EcHcL與日本沼蝦血藍(lán)蛋白親緣關(guān)系最近, 疣酋婦蟹、中華絨螯蟹、斑點(diǎn)海虱等甲殼動(dòng)物的血藍(lán)蛋白親緣關(guān)系次之。

圖3 EcHcL基因在脊尾白蝦不同組織中的表達(dá)Fig. 3 EcHcL expression level in different tissues of E. carinicauda

圖4 EcHcL基因在脊尾白蝦肝胰腺組織中的表達(dá)變化Fig. 4 Relative expression of EcHcL in hepatopancreas of E. carinicauda

圖5 EcHcL基因在脊尾白蝦血細(xì)胞中的表達(dá)變化Fig. 5 Relative expression of EcHcL in haemocytes of E. carinicauda

3.2 EcHcL基因在不同組織中的表達(dá)分析

本實(shí)驗(yàn)對EcHcL在不同組織中的表達(dá)量進(jìn)行了測定, 發(fā)現(xiàn)EcHcLmRNA的表達(dá)組織分布廣泛且具有組織特異性, 在肝胰腺最高, 血細(xì)胞次之, 與凡納濱對蝦[18]、中國對蝦[8]的研究結(jié)果一致。此研究支持了肝胰腺是甲殼動(dòng)物血藍(lán)蛋白的主要合成器官的觀點(diǎn)[19]。

3.3 感染后EcHcL基因的表達(dá)分析

近年來的研究發(fā)現(xiàn), 血藍(lán)蛋白具有載氧功能外,還具有凝集活性、酚氧化酶活性、抗菌和抗病毒等作用。目前的研究結(jié)果認(rèn)為血藍(lán)蛋白是構(gòu)成甲殼動(dòng)物免疫防御體系的重要成員之一[20]。章躍陵等[21,22]研究發(fā)現(xiàn)血藍(lán)蛋白蛋白斑點(diǎn)的肽質(zhì)量譜峰值可以與流感病毒的血凝素相匹配, 提示血藍(lán)蛋白可能具有凝集活性; 并發(fā)現(xiàn)血清中與溶藻酸弧菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌等4種病原菌直接結(jié)合的蛋白是血藍(lán)蛋白, 提示血藍(lán)蛋白具有一定的抗菌活性, 并首次證明了血藍(lán)蛋白具有非特異性抗病毒作用[23]。Lee等[24]研究發(fā)現(xiàn)信號小龍蝦血藍(lán)蛋白在酸性環(huán)境下能水解產(chǎn)生抗菌肽, 對革蘭氏陽性菌和陰性菌都有很強(qiáng)的抑制作用。綜上所述, 血藍(lán)蛋白及其降解片段在蝦類的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。在本實(shí)驗(yàn)中, 脊尾白蝦肝胰腺和血細(xì)胞血藍(lán)蛋白基因EcHcL基因在金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌刺激后, 其表達(dá)量表現(xiàn)出一定的時(shí)間依賴性, 總體趨勢表現(xiàn)為先升高后降低。肝胰腺和血細(xì)胞EcHcL表達(dá)量在金黃色葡萄球菌感染后24h內(nèi)發(fā)生輕微浮動(dòng), 在48h達(dá)到最大值,約是對照組的2倍, 隨后下降到與對照組無顯著差異(P＞0.05), 與Lu等[25]研究發(fā)現(xiàn)注射金黃色葡萄球菌后, 凡納濱對蝦血藍(lán)蛋白基因在肝胰腺中表達(dá)量增加顯著結(jié)果相一致, 提示血藍(lán)蛋白具有抗菌作用;血細(xì)胞EcHcL表達(dá)量在金黃色葡萄球菌感染后24h達(dá)到最大值, 約是對照組的2倍, 可能由于球菌的感染激活了血藍(lán)蛋白的免疫活性, 促進(jìn)血藍(lán)蛋白基因的表達(dá), 之后顯著降低, 可能由于蝦血細(xì)胞體液免疫將異物排除體外。脊尾白蝦在受到副溶血弧菌感染后, 肝胰腺EcHcL表達(dá)量隨著時(shí)間增加而增加,在注射12h達(dá)到最大值, 約是對照組的8倍, 隨后逐漸下降, 72h恢復(fù)到與對照組相當(dāng), 與李彥飛[26]研究發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦血藍(lán)蛋白p77亞基在注射病原菌后,12h達(dá)到表達(dá)量達(dá)到最大值之后下調(diào)趨勢一致, 提示血藍(lán)蛋白在蝦類免疫防御體系中具有抗菌作用;血細(xì)胞EcHcL表達(dá)量在24h達(dá)到最大值, 約是對照組的3倍, 隨后逐漸下降, 在72h與對照組無顯著性差異(P＞0.05), 與楊留冰[27]研究發(fā)現(xiàn)注射球菌及弧菌24h后凡納濱對蝦血漿血藍(lán)蛋白亞基表達(dá)量達(dá)到最大值之后下調(diào)趨勢一致, 提示血藍(lán)蛋白具有抗菌作用。經(jīng)金黃色葡萄球菌及副溶血弧菌感染脊尾白蝦后, 在感染后期EcHcL表達(dá)量恢復(fù)到正常水平(圖3), 推測病原菌的入侵激活了脊尾白蝦的免疫防御體系, 血藍(lán)蛋白及血細(xì)胞等免疫因子的共同作用先將病原菌清除[28]。

白斑綜合征病毒是蝦類主要的病毒性疾病之一, 給蝦類養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[29,30], 因此越來越多的學(xué)者對蝦類抗病毒展開研究。近十幾年來研究表明, 對蝦血藍(lán)蛋白具有抗病毒活性。Zhang等[21]將凡納濱對蝦血藍(lán)蛋白分離為分子質(zhì)量為73 kD和75 kD的兩種亞基, 并首次證明血藍(lán)蛋白具有非特異性抗病毒作用。Lei等[31]研究發(fā)現(xiàn)血藍(lán)蛋白能與WSSV和虹彩病毒(Singapore Grouper Irido Virus, SGIV)結(jié)合揭示血藍(lán)蛋白具有抗病毒功能。在本實(shí)驗(yàn)中, 脊尾白蝦肝胰腺及血細(xì)胞EcH-cL基因在WSSV感染后, 與對照組相比具有時(shí)空表達(dá)模式, 表達(dá)量先升高后降低, 分別在12h和24h達(dá)到最高值, 分別約是對照組的4倍和2倍, 與Xu等[32]研究發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦人工感染W(wǎng)SSV后血藍(lán)蛋白基因在肝胰腺中的表達(dá)上調(diào)趨勢一致, 表明血藍(lán)蛋白在蝦類的免疫防御中還具有抗病毒的作用。WSSV感染脊尾白蝦前期在肝胰腺組織及血細(xì)胞中的EcHcL基因表達(dá)量持續(xù)增加, 可能因?yàn)椴《镜膹?fù)制刺激了血藍(lán)蛋白的合成促進(jìn)了免疫應(yīng)答;感染后期, WSSV的擴(kuò)增進(jìn)入對數(shù)期, 抑制了脊尾白蝦的免疫防御系統(tǒng), 使EcHcL表達(dá)量持續(xù)下降。

本實(shí)驗(yàn)對脊尾白蝦血藍(lán)蛋白大亞基基因cDNA全長進(jìn)行了克隆分析, 并研究了其在病原菌及病毒的感染下的表達(dá)規(guī)律, 發(fā)現(xiàn)感染后基因表達(dá)呈現(xiàn)特定的時(shí)空表達(dá)模式, 進(jìn)一步證明了血藍(lán)蛋白具有抗菌和抗病毒雙重作用, 為深入研究血藍(lán)蛋白在對蝦免疫防御系統(tǒng)中的作用積累了資料。

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