何濤+趙娜

摘要：采用腹背聯(lián)合按摩法采集雞精液，預(yù)處理后添加含有不同濃度的紅景天多糖、枸杞多糖和海帶多糖冷凍稀釋液進(jìn)行稀釋，檢測(cè)冷凍解凍后雞精子的活率、質(zhì)膜完整率、線粒體活性、頂體完整率。結(jié)果表明紅景天多糖、枸杞多糖、海帶多糖最佳添加量分別為1.00、0.75、0.50 mg/mL，精子凍后活率穩(wěn)定在40%以上。

關(guān)鍵詞：雞精液；紅景天多糖；枸杞多糖；海帶多糖；種蛋孵化率

中圖分類號(hào)：S814.3；S831 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2018）01-0005-02

隨著人們對(duì)禽類食品需求量的日益增加，中國(guó)養(yǎng)禽業(yè)規(guī)?；c集約化程度逐年提高，人工授精技術(shù)在養(yǎng)禽業(yè)得到了快速發(fā)展?；\養(yǎng)雞的人工輸精大多采用原精，但原精輸精存在一定的缺陷，公雞射精量少、精子密度大、在高溫條件下體外存活時(shí)間短，在公雞使用的早期和晚期易出現(xiàn)精液缺乏現(xiàn)象，雞精液稀釋技術(shù)可有效解決這類問(wèn)題[1]。好的稀釋液不僅可以提供精子生存活動(dòng)的良好環(huán)境，并且將其稀釋可以使密度高、容量低的雞精液分布均勻，能夠擴(kuò)大其精液量，增強(qiáng)其授精能力[2]。本試驗(yàn)主要確定紅景天多糖、海帶多糖、枸杞多糖在雞精液稀釋液中的最佳作用濃度，以提高雞人工輸精后的種蛋孵化率和健雛率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選擇寧夏曉鳴農(nóng)牧股份有限公司的冠大而鮮紅、性反射功能好、精液品質(zhì)符合要求的20只50周齡公雞，根據(jù)日常輸精劃分為兩組，兩組公雞輪換使用，采精2 d，休息1 d。

1.2 試驗(yàn)儀器與試劑

進(jìn)口液氮罐（TAYLOR-WHARTON）；超純水制備器（PureLabTMPlus，Pall公司，德國(guó)）；生物冷凍儀（BIOTRONICS LIMIED，英國(guó)）；倒置熒光顯微鏡（NIKON120型，日本）；全自動(dòng)高速離心機(jī)（Heraeus，德國(guó)）；高壓消毒柜（Thermo電子公司，美國(guó)）；保溫水壺、冰箱、水浴鍋等。

D-葡萄糖（0188-500 g）、D-果糖（F2793-500 mg）、二水檸檬酸三鈉（S4641-500 g）、檸檬酸（北京世紀(jì)星化工有限責(zé)任公司）、碳酸氫鈉、Tris、EDTA、甘油、氯化鈉、氯化鉀、青霉素G鉀（P-7794）、硫酸鏈霉素（0382-25 g）、甘油（0854-100 mL）、卵黃、碘化丙啶、羅丹明123、FITC-PNA、雙蒸水等。

紅景天多糖標(biāo)準(zhǔn)品、枸杞多糖標(biāo)準(zhǔn)品、海帶多糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海源葉生物公司。

冷凍基礎(chǔ)液TCG：葡萄糖1.1 g，檸檬酸1.48 g，Tris 2.42 g，青霉素鈉0.06 g，硫酸鏈霉素0.1 g，加雙蒸水至100 mL，調(diào)節(jié)pH至6.21，滲透壓286 mOsm/L。

精子低滲液：二水檸檬酸鈉0.735 g，果糖1.351 g，加雙蒸水至100 mL。

冷凍保存I液：冷凍基礎(chǔ)液加20%（V/V）的卵黃。

冷凍保存II液：冷凍保存I液添加不同體積比的甘油。

1.3 精液處理

將合格的精液保存在保溫壺（32～35 ℃）中，帶回實(shí)驗(yàn)室后分裝，按照所采精液密度的大小每個(gè)離心管分裝5～10 mL，加等量的BTS液，紗布包裹，15 ℃下平衡3 h。800 g離心10 min，取出，棄上清。加入I液（80%TCG+20%卵黃），按1∶2稀釋。在4 ℃下平衡3 h后，添加甘油使其最終濃度為3%，最終稀釋倍數(shù)為1∶3。在4 ℃下平衡1～2 h。用細(xì)管分裝，封口。然后放入程序冷凍儀中以1 ℃/min從5 ℃降到-5 ℃，迅速取出放置于自制冷凍盒中，在距液氮面3 cm處熏蒸3 min。將超低溫溫度計(jì)探針與冷凍槽連接，當(dāng)溫度降到-120 ℃時(shí)迅速投入液氮保存。解凍，放置37 ℃培養(yǎng)箱中待測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在試驗(yàn)中分別添加濃度梯度為0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/mL紅景天多糖、海帶多糖、枸杞多糖，同時(shí)以TCG作為的對(duì)照，比較解凍后精子的活率、質(zhì)膜完整率、線粒體活性、頂體完整率。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同濃度紅景天多糖對(duì)公雞精子冷凍解凍效果的影響

不同濃度紅景天多糖對(duì)公雞精子冷凍解凍效果的影響見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，添加不同濃度梯度的紅景天多糖均可提高公雞精子凍后活率、質(zhì)膜完整率，頂體完整率、線粒體活性等質(zhì)量參數(shù)。其中以添加1.00 mg/mL的效果最好。

3.2 不同濃度枸杞多糖對(duì)公雞精子冷凍解凍效果的影響

不同濃度枸杞多糖對(duì)公雞精子冷凍解凍效果的影響見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，添加不同濃度梯度的枸杞多糖均可提高公雞精子凍后活率、質(zhì)膜完整率，頂體完整率、線粒體活性等質(zhì)量參數(shù)。其中以添加0.75 mg/mL的精子活率最高。

3.3 不同濃度海帶多糖對(duì)公雞精子冷凍解凍效果的影響

不同濃度海帶多糖對(duì)公雞精子冷凍解凍效果的影響見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，添加不同濃度梯度的海帶多糖均可提高公雞精子凍后活率、質(zhì)膜完整率，頂體完整率、線粒體活性等質(zhì)量參數(shù)。其中以添加0.50 mg/mL的精子活率最高。

4 小結(jié)與討論

紅景天多糖主要用于免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗凝血、降血脂、和血糖、抗輻射、抗氧化、抗突變、耐缺氧及抗疲勞等[3]。枸杞多糖（LBP）是由阿拉伯糖，鼠李糖，木糖，甘露糖，半乳糖和葡萄糖中性單糖和半乳糖醛酸及18種氨基酸等組成，作為傳統(tǒng)的中草藥提取物，具有抗衰老、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)血糖等多種生物活性[4]。海帶多糖作為傳統(tǒng)的中草藥提取物，具有抗衰老、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)血糖等多種生物活性[5]。其原理是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞脫水和在胞膜外形成保護(hù)膜來(lái)保持細(xì)胞的活性[6]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，按不同濃度梯度在稀釋液中添加0.25～1.25 mg/mL的紅景天多糖、枸杞多糖和海帶多糖可提高公雞精子凍后活率、質(zhì)膜完整率，頂體完整率、線粒體活性等質(zhì)量參數(shù)。

本試驗(yàn)將3種多糖應(yīng)用到公雞精子冷凍方面，試驗(yàn)結(jié)果令人驚喜，其對(duì)公雞精子冷凍保存的保護(hù)作用可能源于多糖所具有的較強(qiáng)抗氧化性、抗衰老和防止細(xì)胞凋亡等特性，也可能是由于抑制了活性氧的產(chǎn)生，提高了過(guò)氧化物酶的活性，使細(xì)胞質(zhì)膜免受脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，防止了細(xì)胞內(nèi)酶類的外流[7]。但是多糖的構(gòu)成成分復(fù)雜，結(jié)構(gòu)多變，造成溶液的滲透壓偏高，公雞精子對(duì)滲透壓較為敏感，所以應(yīng)嚴(yán)格把握3種多糖的添加量。

多糖用途廣泛，主要用于免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗凝血、降血脂和血糖、抗輻射、抗氧化、抗突變、耐缺氧及抗疲勞等。紅景天多糖、枸杞多糖、海藻多糖在很多領(lǐng)域都有相關(guān)的研究和探討。本試驗(yàn)將其應(yīng)用到公雞精子冷凍方面，在公雞的精液冷凍過(guò)程中，在傳統(tǒng)的稀釋液TCG基礎(chǔ)上，添加紅景天多糖、枸杞多糖、海帶多糖均可以提高精子凍后活率、頂體完整性、線粒體活性和質(zhì)膜完整率，與對(duì)照組比較差異顯著（P<0.05），結(jié)果證實(shí)紅景天多糖、枸杞多糖、海帶多糖最佳添加量分別為1.00、0.75、0.50 mg/mL。 其中以1.00 mg/mL紅景天多糖冷凍保護(hù)效果較好。

參考文獻(xiàn)：

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