湯亞方，曾偉偉，王 慶，王英英，石存斌，馮 茹，高 輝，王承寶

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌，712100；2.農(nóng)業(yè)部漁藥創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國水產(chǎn)科學(xué)院珠江水產(chǎn)研究所，廣州，510380)

草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)致病力強(qiáng)，傳播速度快，感染該病毒而導(dǎo)致的草魚出血病(grass carp hemorrhage disease，GCHD)發(fā)病季節(jié)長、流行范圍廣、死亡率高，嚴(yán)重危害我國草魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[1-3]。草魚的天然免疫在抵擋病毒等入侵方面發(fā)揮著重要作用，其體內(nèi)的模式識(shí)別受體主要分為4類：Toll樣受體(TLRs)、維甲酸誘導(dǎo)基因(RIG)I樣受體(RLRs)、NOD樣受體(NLRs)、C型凝集素受體(CLRs)，這四種模式識(shí)別受體在體內(nèi)通過不同信號(hào)傳導(dǎo)途徑在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗病毒免疫反應(yīng)。過去幾十年里，通過對病原體的識(shí)別、致病規(guī)律、硬骨魚類抗病毒免疫網(wǎng)絡(luò)機(jī)制的研究等方面逐漸深入，草魚出血病的預(yù)防措施正在不斷完善和加強(qiáng)[4]。GCRV基因組由11個(gè)分節(jié)段的dsRNA組成，編碼7種結(jié)構(gòu)性多肽(VP1-VP7)，5種非結(jié)構(gòu)性多肽(NS1-NS5)[5,6]。由于病毒基因組分節(jié)段，使得不同毒株之間可以發(fā)生重配而產(chǎn)生高度變異的新株型，目前已知的GCRV有40多個(gè)分離株，其中部分已完成基因組測序[7]，關(guān)于GCRV基因組的分型目前尚未形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，但普遍共識(shí)是我國流行的GCRV毒株分為至少I、Ⅱ、Ⅲ型[2,8-10]三種基因型。近幾年我國草魚出血病病原調(diào)查分析表明，當(dāng)前我國的草魚出血病呈現(xiàn)出不同基因型病毒單獨(dú)感染和混合感染的態(tài)勢，其中Ⅱ型占96%以上，為當(dāng)前的主要流行基因型[7]。

生物信息學(xué)分析表明，GCRVⅡ型毒株S9基因節(jié)段編碼一個(gè)長達(dá)418 aa的蛋白質(zhì)(VP6)，分子質(zhì)量約為42.86 ku[11]；GCRVⅡ型毒株S9基因編碼核苷酸序列和氨基酸序列的同源性均96%以上。Fang等[5]的研究表明，VP6蛋白參與GCRV病毒粒子內(nèi)衣殼蛋白的構(gòu)成，能連接內(nèi)衣殼和外衣殼，因此推測GCRVⅡ型 S9基因編碼的蛋白為一種結(jié)構(gòu)蛋白。本實(shí)驗(yàn)選取GCRVⅡ型代表毒株GCRV-HZ08株，PCR擴(kuò)增S9基因片段、構(gòu)建原核表達(dá)載體誘導(dǎo)VP6蛋白表達(dá)，蛋白純化后免疫新西蘭兔制備多克隆抗體，并采用Western blot和間接免疫熒光試驗(yàn)初步分析制備的多克隆抗體的免疫學(xué)特性，意在為GCRVⅡ型病毒S9基因節(jié)段編碼蛋白的功能研究、GCRV Ⅱ型病原學(xué)特性研究以及草魚出血病的臨床診斷和防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

GCRV GZ1208、HZ08、HuNan1307株，鱖彈狀病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)，錦鯉皰疹病毒(Kio herpesvirus,KHV)，大嘴鱸魚病毒(large-mouth Bass virus,LMBV)，傳染性脾腎壞死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)均由珠江水產(chǎn)研究所魚病室分離并保存；HGDRV株由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所惠贈(zèng)；草魚魚鰾上皮細(xì)胞(GSB)、鯉魚上皮瘤細(xì)胞(EPC)、錦鯉尾鰭細(xì)胞(KF)均由本實(shí)驗(yàn)室保存；M199培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)，大腸桿菌DH5α(E.coliDH5α)感受態(tài)、大腸桿菌BL21(DE3)(E.coliBL21)感受態(tài)，PCR試劑盒，BamHⅠ酶、XholI酶，T4 Ligase和質(zhì)粒提取試劑盒等均購自TaKaRa公司(中國大連)；膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司(美國)；pET-32a(+)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；SDS-PAGE試劑盒、DAB顯色試劑盒等購自康為世紀(jì)有限公司(中國北京)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體重約1.5～2.0 kg的雌性新西蘭兔3只，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 PCR擴(kuò)增S9基因

根據(jù)GenBank(GU350746.1；HQ231205.1；KM 880073.1；KR180376.1；KU254574.1； KF712483.1；KC847328.1；KC201185.1)中GCRV Ⅱ型S9基因保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)1對引物，上游引物：5′-GAT GGA TCC ATA GTC TCG GAA GCC TAC CAA-3′；下游引物：5′-ATA CTC GAG AGC ACG CGT CCA GTT ATT-3′(下劃線序列分別為BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn))。每25 μL反應(yīng)體系中加入2.5 μL 10×PCR reaction buffer，0.5 μL dNTP(10 mmol/L)，上、下游引物分別為0.5 μL，2 μL GCRV-HZ08株cDNA作為模版，LA Taq酶0.25 μL，ddH2O 18.75 μL；PCR反應(yīng)按如下程序進(jìn)行：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.4 構(gòu)建pET-32a-S9原核表達(dá)載體

用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ對PCR擴(kuò)增的S9片段和表達(dá)載體pET-32a(+)進(jìn)行雙酶切處理，37 ℃反應(yīng)2 h，回收酶切后的目的片段和載體片段并連接，連接反應(yīng)體系為T4 Ligase 1.5 μL，T4 Ligase buffer 1.5 μL，pET-32a(+)載體 5 μL，S9目的片段8 μL，16 ℃反應(yīng)4 h。取E.coliDH5α將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入其中，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定正確后，送樣至廣州艾基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證，經(jīng)驗(yàn)證正確的重組載體定名為pET-32a-S9。

1.5 VP6蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)形式分析

將上述鑒定正確的pET-32a-S9重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coilBL21(DE3)中，篩選的陽性菌落挑至LB/Amp液體培養(yǎng)基置于恒溫?fù)u床中擴(kuò)大培養(yǎng)，測定光密度為(A600 nm=0.6)時(shí)，加入IPTG(終濃度1 mmol/L)誘導(dǎo)。誘導(dǎo)結(jié)束后收集菌體，超聲波(工作5 s，間歇10 s，功率250 W)裂解菌體，裂解菌體時(shí)注意保持低溫環(huán)境，收集破碎后的上清和沉淀，將上清和沉淀分別標(biāo)記為溶液A、溶液B。SDS-PAGE分析目的蛋白的表達(dá)情況和表達(dá)形式，同時(shí)設(shè)立空載體pET-32a(+)作為陰性對照。

1.6 優(yōu)化IPTG誘導(dǎo)條件

最優(yōu)誘導(dǎo)表達(dá)條件采用棋盤法進(jìn)行篩選。重組質(zhì)粒pET-32a-S9轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)后，挑取篩選的陽性克隆至LB/Amp液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床上(200 r/min、37 ℃)培養(yǎng)12 h。在3 mL LB/Amp培養(yǎng)基中加入30 μL上述菌液，恒溫?fù)u床(轉(zhuǎn)速、溫度同上)上繼續(xù)培養(yǎng)，至光密度(A600 nm分別設(shè)為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0，以實(shí)際測定為準(zhǔn))，分別加入IPTG(IPTG終濃度設(shè)為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mmol/L)誘導(dǎo)，繼續(xù)在恒溫?fù)u床(轉(zhuǎn)速、溫度同上)中培養(yǎng)10 h，離心收集菌體，對重組目的蛋白的相對表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.7 目的蛋白純化

上述可溶性分析顯示重組蛋白為包涵體蛋白，棋盤法篩選最佳誘導(dǎo)條件為，在OD600 nm約為1.0，IPTG終濃度為1.6 mmol/L時(shí)，目的蛋白的表達(dá)量最高，可達(dá)70%以上。在最優(yōu)誘導(dǎo)條件下將導(dǎo)入重組質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)大量誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，再加入PBS重懸，在冰上超聲波(工作5 s，間歇10 s，功率250 W)破碎菌體至溶液澄清。將破碎液離心，收集沉淀，按Ni-凝膠純化試劑盒(包涵體蛋白純化)說明書的步驟純化表達(dá)的重組VP6蛋白，收集洗脫液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 多克隆抗體的制備

選取3只2月齡，質(zhì)量為1.5～2.0 kg左右的健康雄性新西蘭兔，其中1只每次注射等量生理鹽水為陰性對照。每次將純化的重組蛋白經(jīng)無菌生理鹽水稀釋后與佐劑按1∶1比例乳化，免疫方法為背部皮下多點(diǎn)注射，每只注射2 mL(抗原含量200 μg)，初次免疫使用完全弗氏佐劑，之后均使用弗氏不完全佐劑。第0周、第2周、第4周、第6周各免疫一次，并于第7周進(jìn)行耳緣靜脈采血測定抗體效價(jià)。效價(jià)符合要求后，進(jìn)行心臟采血，收集血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 間接ELISA檢測血清抗體效價(jià)

將pH 9.6的碳酸鹽緩沖液按1∶104稀釋純化的重組蛋白(50 ng/mL)作為包被液，包被96孔酶標(biāo)板，每孔100 μL，置于4 ℃冰箱過夜；每孔滴加1% BSA 200 μL置于37 ℃封閉2 h；封閉結(jié)束后加入等梯度稀釋(1∶101、1∶102、1∶103、1∶104、1∶105、1∶106、1∶107、1∶108、1∶109、1∶1010)的血清各100 μL， 37 ℃作用2 h；然后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)100 μL，37 ℃作用1 h；以上每步反應(yīng)結(jié)束后都用PBST緩沖液洗板3～5次，每次5 min；最后用TMB顯色試劑盒顯色，終止顯色用0.5 mol/L的H2SO4溶液。酶標(biāo)儀上讀取A450 nm值(當(dāng)A450 nm≥0.277，且大于陰性對照2.1倍時(shí)，判定為陽性)。對照組設(shè)置相應(yīng)稀釋倍數(shù)的陰性血清。

1.10 Western blot分析

將純化的VP6重組蛋白、濃縮的GCRV HZ08、GZ1208、104、KHV、ISKNV、LBMV和SCRV病毒進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將分離的蛋白通過半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移至NC膜上，于2%的BSA封閉液中室溫封閉2 h；一抗為1∶1 000稀釋的上述血清，37 ℃作用2 h；二抗為1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，37 ℃作用1 h；每次反應(yīng)后均用TBST洗3～5次，每次5 min，最后用DAB顯色劑顯色并觀察結(jié)果。

1.11 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)

將GSB、EPC和KF細(xì)胞傳代至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長至單層鋪滿80%左右后，GSB細(xì)胞接種GCRV-HZ08、HuNan1307、GZ1208、HGDRV病毒，EPC細(xì)胞接種ISKNV、LBMV、SCRV病毒，KF細(xì)胞接種KHV病毒，設(shè)置未接種病毒的正常細(xì)胞作為陰性對照。攻毒5 d后，吸凈細(xì)胞培養(yǎng)板上的培養(yǎng)基，PBS(0.01 mol/L)洗滌3次，使用80%丙酮溶液固定，反應(yīng)結(jié)束后吸凈細(xì)胞培養(yǎng)板上的丙酮，室溫下干燥；一抗為1∶1 000稀釋的兔抗VP6蛋白多克隆抗體，滴加100 μL，37 ℃作用1 h，PBST洗滌3次，每次5 min；二抗為1∶50稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，滴加100 μL，37 ℃作用1 h，PBST洗滌3次，每次5 min，最后加入碘化丙啶染料，熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果(見圖1)顯示，在約750 bp處出現(xiàn)一條特異性條帶，與預(yù)期大小一致，陰性對照無任何條帶。

圖1 PCR擴(kuò)增S9基因產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of amplification result for S9 gene PCR products1.陰性對照；2.S9基因PCR產(chǎn)物；M.DNA Marker DL 1000

2.2 雙酶切鑒定重組表達(dá)載體

使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ對重組質(zhì)粒pET-32a-S9進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果(見圖2)顯示一大小約為750 bp的特異性條帶；經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司測序，結(jié)果顯示目的片段及閱讀框均正確。

2.3 VP6蛋白的表達(dá)和表達(dá)形式分析

SDS-PAGE電泳結(jié)果(見圖3)顯示，泳道1、2中未出現(xiàn)明顯表達(dá)的蛋白條帶，泳道4中約42 ku處出現(xiàn)一條明顯的重組蛋白條帶，與預(yù)期大小相符；泳道3中未見明顯的重組蛋白條帶，泳道5中重組蛋白含量較多。上清溶液A中重組蛋白含量很低，目的蛋白主要存在于溶液B中，說明目的蛋白主要以包涵體形式存在。

圖2 重組質(zhì)粒pET-32a-S9雙酶切鑒定結(jié)果電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of digestion identification of pET-32a-S9 recombinant plasmid M.DNA Marker DL 15000；pET-S9.重組質(zhì)粒 pET-32a-S9雙酶切產(chǎn)物

圖3 SDS-PAGE分析重組質(zhì)粒pET-32a-S9 表達(dá)產(chǎn)物及其可溶性Fig.3 SDS-PAGE analysis results for the expression product of pET-32a-S9 recombinant protein and its the dissolubility of the recombinant protein M.低相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)marker；1.pET-32a(+) 空載體的誘導(dǎo)表達(dá)；2.pET-32a-S9重組載體未經(jīng) IPTG誘導(dǎo)對照；3.上清溶液A；4.pET-32a-S9 重組載體的誘導(dǎo)表達(dá)；5.沉淀溶液B

2.4 純化蛋白的鑒定

與泳道3中未純化的蛋白相比，泳道1中純化的VP6重組蛋白在約42 ku處條帶單一，無其他明顯雜帶；泳道2中的Ni柱流穿液在約42 ku處有少量條帶，蛋白純化效果較好(見圖4)。

圖4 S9基因編碼重組蛋白經(jīng)Ni柱純化后 SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE analysis results for the purified protein products of S9 gene coding recombinant protein1.純化的VP6重組蛋白；2.Ni柱流穿液； 3.未純化的菌體總蛋白；M.低相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)marker

2.5 血清抗體效價(jià)的檢測

使用間接ELISA方法測定血清效價(jià)，結(jié)果顯示該VP6重組蛋白多克隆抗體效價(jià)約為1∶105。

2.6 Western blot分析

Western blot結(jié)果(見圖5)顯示，加入純化的VP6蛋白的泳道中，約42 ku處出現(xiàn)一條特異性條帶；加入純化的HZ08株的泳道中，約48 ku處出現(xiàn)一條特異性條帶；而加入GZ1208、HGDRV、ISKNV、LBMV、SCRV、KHV病毒的孔道中未出現(xiàn)條帶。重組蛋白和GCRV Ⅱ型毒株能與制備的多抗血清特異結(jié)合，其他病毒與該多抗血清無特異性反應(yīng)，表明該多克隆抗體特異性高。

圖5 Western blot分析VP6蛋白抗血清特性Fig.5 Western blot appraise the peculiarity of serum antibody against VP6 protein1.KHV病毒；2.ISKNV病毒；3.LBMV病毒； 4.SCRV病毒；5.HGDRV病毒；6.GCRV-GZ1208 病毒；7.VP6重組蛋白；8.純化的HZ08毒株； M.低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)marker

2.7 間接免疫熒光分析

間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖6)顯示，感染GCRV-HuNan1307株和HZ08株的GSB細(xì)胞產(chǎn)生特異性的綠色熒光信號(hào)，而感染GZ1208、HGDRV毒株的GSB細(xì)胞以及未感染病毒的正常GSB細(xì)胞中觀察不到熒光信號(hào)；感染ISKNV、LBMV、SCRV毒株的EPC細(xì)胞和感染KHV毒株的KF細(xì)胞中均未見到熒光信號(hào)。表明制備的多克隆抗體能特異性識(shí)別GCRV Ⅱ型毒株，而不能識(shí)別GCRV Ⅰ型和Ⅲ型以及其它病毒。

圖6 間接免疫熒光分析VP6蛋白抗血清特性Fig.6 IFA identification of the polyclonal antibody1.感染HuNan1307株的GSB細(xì)胞；2.感染 HZ08株的GSB細(xì)胞；3.未感染病毒的正常GSB 細(xì)胞對照；4.感染GZ1208的GSB細(xì)胞；5.感染 HGDRV的GSB細(xì)胞；6.感染ISKNV的EPC細(xì)胞； 7.感染LBMV的EPC細(xì)胞；8.感染SCRV的EPC 細(xì)胞；9.感染KHV的KF細(xì)胞

3 討論

VP6蛋白參與GCRV病毒粒子內(nèi)衣殼蛋白的構(gòu)成，能連接內(nèi)衣殼和外衣殼，與哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒的δ2蛋白功能相似[5]。呼腸病毒科包括輪狀病毒屬和水生動(dòng)物呼腸孤病毒屬，研究人員在對輪狀病毒VP6蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，VP6蛋白具有高度的免疫原性，但不誘導(dǎo)中和抗體，針對VP6蛋白的抗體在感染輪狀病毒的實(shí)驗(yàn)組中具有高度的交叉反應(yīng)性，推測VP6抗體可提供潛在的特異性免疫保護(hù)[12]。此外，在一些針對草魚出血病疫苗研發(fā)的研究中，以VP6蛋白作為免疫原可以提供高水平的免疫保護(hù)[13-15]，因此，VP6蛋白可以認(rèn)為是一種用于免疫測定的良好靶蛋白[16]，可以作為制備草魚出血病基因工程疫苗的候選蛋白。Fang等[17]成功在昆蟲細(xì)胞(sf9)中融合表達(dá)了GCRV VP6蛋白與熒光增強(qiáng)蛋白(EGFP)；周勇等[18]構(gòu)建了GCRV VP6蛋白與綠色熒光蛋白、大腸桿菌LTB亞基植物融合表達(dá)載體，這些研究結(jié)果為研發(fā)草魚出血病可飼性轉(zhuǎn)基因動(dòng)、植物疫苗提供了新思路。Zhou等[19,20]使用GCRV Ⅲ型(HGDRV株)VP6蛋白制備的小鼠多克隆抗體具有高特異性；制備的GCRV Ⅲ型(HGDRV株)VP6蛋白DNA疫苗，在免疫應(yīng)答早期的效果評價(jià)中，該DNA疫苗能夠在一定程度上抑制GCRV的增殖以及該病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病變效應(yīng)，顯示了良好的免疫效果。

本實(shí)驗(yàn)以GCRV Ⅱ型代表毒株GCRV-HZ08的S9基因?yàn)檠芯繉ο?，擴(kuò)增S9基因，并成功構(gòu)建pET-32a-S9原核表達(dá)載體，蛋白表達(dá)形式分析顯示該VP6蛋白主要存在于沉淀中，為包涵體蛋白。測定使用該VP6蛋白制備的多克隆抗體效價(jià)，結(jié)果顯示制得的多克隆抗體效價(jià)約為1∶105，遠(yuǎn)高于GCRV Ⅱ型(GCRV-HZ08株)S6片段表達(dá)的VP4蛋白制備的多克隆抗體效價(jià)(約1∶8 000)[21]，但比HZ08株S10基因片段表達(dá)的蛋白制備的多克隆抗體效價(jià)(約1∶106)略低[22]。S9片段編碼的蛋白誘導(dǎo)制備的抗體效價(jià)較高，說明該VP6蛋白免疫原性較好，可以作為研制草魚出血病基因工程疫苗的候選蛋白。經(jīng)Western blot和IFA分析可知，制備的多克隆抗體能特異性識(shí)別GCRV Ⅱ型毒株，而不能識(shí)別GCRV Ⅰ型和Ⅲ型以及其它病毒，表明該多克隆抗體具有較高的特異性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為S9基因片段編碼蛋白功能的深入研究、抗原表位分析、基因工程疫苗的研制以及草魚出血病的防治奠定了基礎(chǔ)；同時(shí)，結(jié)合Fang、周勇等[17,18]的研究也為我們開發(fā)草魚出血病可飼性轉(zhuǎn)基因動(dòng)、植物疫苗的研究提供了新思路。

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