周南陽+趙虹

[摘要] 目的 探討隱丹參酮對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移、侵襲的影響及其機制。 方法 用不同濃度的隱丹參酮處理 MDA-MB-231 細(xì)胞24 h。采用 MTT、劃痕實驗和Transwell侵襲實驗測定不同濃度隱丹參酮對MDA-MB-231細(xì)胞活性、遷移和侵襲的影響。采用Western blot檢測MDA-MB-231細(xì)胞中c-Src、p-c-Src Tyr416、FAK、p-FAK Tyr576/577、MMP2蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 與0 μmol/L對照組相比，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L隱丹參酮組對 MDA-MB-231 細(xì)胞存活率顯著降低，且呈劑量依賴（P<0.05）。與對照組相比，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L隱丹參酮組對MDA-MB-231 細(xì)胞遷移、侵襲率均顯著降低，且呈劑量依賴（P<0.05）。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，不同濃度組經(jīng)隱丹參酮處理的 MDA-MB-231 細(xì)胞，MMP2蛋白水平和 c-Src、FAK蛋白的磷酸化水平均顯著下調(diào)（P<0.05）。 結(jié)論 隱丹參酮可抑制三陰乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞活性、遷移和侵襲，其機制可能與其下調(diào)c-Src/FAK通路和MMP2表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 隱丹參酮；乳腺癌；MDA-MB-231細(xì)胞；遷移；侵襲

[中圖分類號] R273 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）35-0016-05

[Abstract] Objective To investigate the effects and molecular mechanism of Cryptotanshinone on migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells. Methods MDA-MB-231 cells were treated with different concentrations of Cryptotanshinone for 24 h. The effects of Cryptotanshinone on cell viability， migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells were assessed by MTT assay， wound healing assay and Transwell invasion assay. The protein levels of c-Src， p-c-Src Tyr416， FAK， p-FAK Tyr576/577， MMP2 were detected by Western blot. Results The results showed that 5 μmol/L， 10 μmol/L， 20 μmol/L， 40 μmol/L Cryptotanshinone groups significantly reduced the viability ability of MDA-MB-231 cells in a dose-dependent manner， compared with the control group（P<0.05）. 5 μmol/L， 10 μmol/L， 20 μmol/L Cryptotanshinone groups significantly inhibited the the abilities of migration and invasion of MDA-MB-231 cells in a dose-dependent manner， compared with the control group（P<0.05）. The result of Western blot showed that Cryptotanshinone inhibited the expression of MMP2 and the phosphorylation of c-Src、FAK in a dose-dependent manner in MDA-MB-231 cells（P<0.05）. Conclusion These results suggest that Cryptotanshinone may suppress the viability， migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells by inhibiting c-Src/FAK pathway and the expression of MMP2.

[Key words] Cryptotanshinone； Breast cancer； MDA-MB-231 cells； Migration； Invasion

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年增加，目前居女性癌死亡率的第一位[1]。其中，全世界每年約1000 000乳腺癌新增病例中超過17%的患者為三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）[1-2]。三陰性乳腺癌是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）與人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor- 2，Her-2）均為陰性的一類乳腺癌[1-3]。由于其惡性程度和侵襲性高，易在短期內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，且其對雌、孕激素受體表達(dá)陽性和Her-2過表達(dá)的乳腺癌的靶向治療不敏感，因此生存率比非三陰性乳腺癌差[2-3]。目前，三陰性乳腺癌治療方法研究成為國際上乳腺癌研究的熱點之一[1-3]。隱丹參酮（cryptotanshinone）是從唇形科植物丹參根中提取分離的二萜醌類有效單體，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性和藥理效應(yīng)[4-5]。近來文獻(xiàn)報道，隱丹參酮具有抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移等作用，然而有關(guān)隱丹參酮對乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用及其機制目前尚不完全清楚[6]。本研究以三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞為研究對象，用不同濃度隱丹參酮干預(yù)，檢測其活性、遷移和侵襲能力，檢測遷移、侵襲相關(guān)分子基質(zhì)金屬蛋白酶 2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）表達(dá)水平和c-Src 激酶、黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）磷酸化水平，從而觀察隱丹參酮對MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲的影響，并初步探討其機制，現(xiàn)報道如下。endprint

1 材料與方法

1.1 材料來源

乳腺癌 MDA-MB-231細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫；隱丹參酮購自成都曼思特生物科技有限公司（純度>98%）（圖1）。將隱丹參酮溶于DMSO配制成等20 mmol/L的儲備液，分裝后于-20℃儲存，避光保存；使用時用無血清 RPMI 1640 培養(yǎng)液稀釋為5 μmol/L，10 μmol/L，20 μmol/L，40 μmol/L的工作液，DMSO終濃度為 0.1%，對照組為含0.1% DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液。胎牛血清和 RPMI 1640 培養(yǎng)基購自Hyclone 公司；兔抗人 c-Src、p-c-SrcTyr416、FAK、p-FAK Tyr576/577、MMP2和 β-actin 抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG購自 Cell Signaling Technology公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自美國Bio-Rad公司；Transwell 小室購自Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國 BD 公司；結(jié)晶紫染色液和RIPA裂解液購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌 MDA-MB-231 細(xì)胞在37℃，5% CO2條件下，常規(guī)培養(yǎng)于含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基。待細(xì)胞長滿至80%左右單層時，用含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液進(jìn)行消化、傳代，取生長良好的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞活性 取MDA-MB-231細(xì)胞，接種于96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)1×104/孔，每組5個復(fù)孔。培養(yǎng) 24 h后，吸棄原培養(yǎng)液，各孔分別加入 200 μL 含有不同濃度隱丹參酮的工作液（0、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L），同時設(shè)調(diào)零孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，利用 MTT 法在波長 490 nm 處檢測各組樣品吸光度值（A490）。細(xì)胞存活率=（實驗組A值-對照組A值）/（對照組A值-空白組A值）×100%，對照組定義為 100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 細(xì)胞劃痕遷移實驗 取對數(shù)生長期MDA-MB-231細(xì)胞，接種于6孔板，1×106/孔，待細(xì)胞長滿后，更換為不同濃度隱丹參酮的工作液（0、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后用20 μL槍頭于每孔中間做一劃痕，用PBS將未貼壁的細(xì)胞洗去，加入2 mL無血清 RPMI 1640 培養(yǎng)液，劃痕后24 h，于顯微鏡下拍照并計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)量，對照組定義為100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 Transwell侵襲實驗 取對數(shù)生長期MDA-MB-231細(xì)胞，接種于6孔板，1×106/孔，待細(xì)胞融合至 80%時，更換為不同濃度隱丹參酮的工作液（0、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)24 h。預(yù)先將基質(zhì)膠用RPMI1640 培養(yǎng)基以 1：7～1：8 稀釋后，每個小室內(nèi)加入 50 μL，4℃風(fēng)干過夜，然后小心吸出小室內(nèi)殘余液體，每孔加 50 μL無血清培養(yǎng)液，置于 37℃孵箱內(nèi)，放置 30 min備用。取密度為 4×105/mL的各組細(xì)胞懸液100 μL加入上室內(nèi)，每組均設(shè)復(fù)室。在下室中加入600 μL含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。取出Transwell小室，用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞和基質(zhì)膠，用PBS清洗兩遍，4%的多聚甲醛固定液固定 30 min，1%結(jié)晶紫溶液中染色15 min，PBS 洗滌3次，風(fēng)干，取下Insert膜，封片后在顯微鏡高倍鏡下，隨機選取10個視野，對侵襲至膜背面的細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行計數(shù)并拍照，取均值。對照組定義為 100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot檢測蛋白水平 取對數(shù)生長期MDA-MB-231細(xì)胞，接種于6孔板，1×106/孔，待細(xì)胞融合至80%時，更換為不同濃度隱丹參酮的工作液（0、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，4℃預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入75 μL細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白，bradford法測蛋白質(zhì)濃度。取25 μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜，用5%BSA/TBST封閉液室溫下封閉1 h，洗膜后加入抗 c-Src、p-c-SrcTyr416、FAK、p-FAK Tyr576/577、MMP2和 β-actin-抗（1∶1 000稀釋），4°C孵育過夜，TBST 洗膜3次，加入二抗（1∶1 000 稀釋）室溫下孵育2 h，TBST洗膜3 次，將化學(xué)發(fā)光增強液A和B等體積混勻涂抹于PVDF膜上，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用 SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni 校正的t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隱丹參酮對MDA-MB-231細(xì)胞活性的影響

用MTT法檢測隱丹參酮對MDA-MB-231細(xì)胞活性的影響，結(jié)果顯示，在隱丹參酮作用24 h后，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L組對MDA-MB-231細(xì)胞活性的抑制率分別為（12.22±1.04）%，（22.93±0.83）%，（37.51±1.00）%，（50.59±0.48）%。與對照組相比，各濃度隱丹參酮組對MDA-MB-231細(xì)胞存活率顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。兩兩比較結(jié)果顯示，各濃度之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明隱丹參酮可顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞活性，且呈劑量依賴（圖2）。endprint

2.2 隱丹參酮抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移情況

用劃痕實驗檢測隱丹參酮對MDA-MB-231細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果顯示，隱丹參酮處理后，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L組對MDA-MB-231細(xì)胞遷移的抑制率分別為（29.01±1.85）%，（51.23±4.05）%，（68.72±2.49）%。與對照組相比，各濃度隱丹參酮組對MDA-MB-231細(xì)胞遷移率顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。兩兩比較結(jié)果顯示，各濃度之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明隱丹參酮可顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移，且呈劑量依賴（圖3）。

2.3 隱丹參酮抑制MDA-MB-231細(xì)胞侵襲情況

用Transwell侵襲實驗檢測隱丹參酮對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲的影響。結(jié)果顯示，隱丹參酮處理后，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L組對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲的抑制率分別為（58.00±4.30）%，（68.10±1.94）%，（78.09±2.05）%。與對照組相比，各濃度隱丹參酮組對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲率降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。兩兩比較結(jié)果顯示，各濃度之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明隱丹參酮可顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞侵襲，且呈劑量依賴（圖4）。

2.4 隱丹參酮對MMP-2蛋白表達(dá)及c-Src、FAK蛋白磷酸化的影響

用Western blot檢測隱丹參酮對MDA-MB-231細(xì)胞遷移、侵襲密切相關(guān)分子MMP2 表達(dá)水平和c-Src、FAK磷酸化水平。結(jié)果顯示，在隱丹參酮作用24 h后，與0 μmol/L對照組相比，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L組MDA-MB-231細(xì)胞中MMP2 表達(dá)水平和c-Src、 FAK蛋白磷酸化水平均顯著下降（P<0.05），且各濃度之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖 5、表1）。

3 討論

隱丹參酮是中藥丹參根中提取的二萜醌類有效單體，因其具有菲并呋喃結(jié)構(gòu)且D環(huán)上C15與C16之間為單鍵而呈現(xiàn)獨特的藥理活性，且其藥動學(xué)特征符合二室開放模型，是近年來國內(nèi)外學(xué)者對中藥單體中研究較多的活性成分之一[7]。已有實驗證實，隱丹參酮可有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制血管生成，從而發(fā)揮其抗腫瘤的作用[4]。新近研究報道，隱丹參酮可通過抑制MMP2和MMP9的表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲，通過激活Caspase信號途徑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡[8]。Shen L等[9]研究發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)外肝癌模型中，隱丹參酮可通過下調(diào)STAT3蛋白磷酸化，增加了Bcl-2的表達(dá)，降低了Bax的表達(dá)，從而增強三氧化二砷誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，隱丹參酮在體外可顯著抑制三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞活性、遷移和侵襲，且呈劑量依賴性。Western blot結(jié)果表明隱丹參酮顯著抑制 MDA-MB-231細(xì)胞中c-Src和FAK 蛋白的磷酸化，同時下調(diào)MMP2蛋白表達(dá)，初步揭示了隱丹參酮抑制乳腺癌 MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲的分子機制。目前有動物實驗結(jié)果表明，在人肺癌裸鼠原位移植模型中，隱丹參酮能有效抑制腫瘤形成，誘導(dǎo)其凋亡，同時改善機體狀況[10]。有關(guān)隱丹參酮體內(nèi)抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的有效性與安全性有待進(jìn)一步研究。另有文獻(xiàn)報道，隱丹參酮可通過STAT3信號誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞凋亡[4]，有關(guān)隱丹參酮對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的影響及其機制有待進(jìn)一步研究。

c-Src是一種非受體型的酪氨酸激酶，由原癌基因 c-Src編碼，分子量約為 60 kDa[11]。在正常細(xì)胞中，c-Src處于抑制狀態(tài)；在癌變或處于有絲分裂期的細(xì)胞中，c-Src羧基端的Tyr530去磷酸化和Tyr 416自身磷酸化，使c-Src蛋白被完全活化?；罨?c-Src 將 FAK 磷酸化，然后二者形成復(fù)合物，誘導(dǎo)黏著斑翻轉(zhuǎn)，介導(dǎo)肌動蛋白重塑，促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲[12]。c-Src在多種腫瘤細(xì)胞中高度活化和/或過量表達(dá)，如肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、卵巢癌和肺癌等[13]。研究發(fā)現(xiàn)，三陰乳腺癌常伴有c-Src的激活和過表達(dá)，與三陰乳腺癌的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展密切相關(guān)[14]，而沉默 c-Src 基因表達(dá)可抑制人三陰乳腺癌 MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲[15]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)5 μmol/L 隱丹參酮可顯著抑制MDA-MB-231 細(xì)胞c-Src和 FAK 磷酸化水平，且隨濃度增加作用增強。提示隱丹參酮可能通過下調(diào)c-Src/FAK通路抑制MDA-MB-231 細(xì)胞遷移、侵襲。

MMP2是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，其基因位于人類染色體16q21，分子量約為72 kDa，它能降解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用[16-17]。大量臨床研究和實驗研究表明，MMP2的高表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，如乳腺癌、胃癌、肺癌、胰腺癌等[16-18]。有文獻(xiàn)報道，下調(diào)MMP2 的蛋白表達(dá)可有效抑制 MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲[19-20]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)5 μmol/L隱丹參酮可顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞MMP2的表達(dá)，且隨濃度增加作用增強。提示隱丹參酮可能通過下調(diào)MMP2表達(dá)抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移、侵襲。

綜上所述，隱丹參酮可抑制三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞活性、遷移和侵襲，其機制可能與其下調(diào)c-Src/FAK通路和MMP2表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果為隱丹參酮抗三陰乳腺癌的中藥分子治療提供了新的依據(jù)和線索。

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（收稿日期：2017-09-11）endprint