張睿怡 綜述 耿 力 審校

北京大學第三醫(yī)院婦產科(100191)

宮頸癌是女性最常見的婦科惡性腫瘤之一，是發(fā)展中國家第二常見腫瘤，僅次于乳腺癌。2012年全球宮頸癌新發(fā)病例52萬余例，死亡病例27萬余例，其中發(fā)展中國家死亡病例約占90%。宮頸癌篩查可以顯著降低宮頸癌的死亡率[1]?，F(xiàn)已知人乳頭瘤病毒(HPV)感染是發(fā)生宮頸癌的主要原因，超過90%的宮頸鱗癌患者可檢測到HPV陽性。但在HPV感染的婦女中只有少數(shù)發(fā)展為宮頸癌，因此，尋找有效宮頸癌篩查方法以及宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的分子生物學指標顯得尤為重要。

1 DNA甲基化

隨著腫瘤發(fā)病機制研究的進展，學者們認識到表觀遺傳學等DNA序列以外的基因調控機制異常在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。其中，DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳學的表現(xiàn)形式之一，是調節(jié)基因功能的重要機制，也是目前表觀遺傳學研究的熱點領域，它參與維持正常細胞功能、遺傳印記、基因沉默等，與腫瘤發(fā)生密切相關。DNA甲基化是表觀遺傳學主要修飾方式，在不改變DNA一級結構的情況下，可使某些基因失活或轉錄遏制，而去甲基化可誘導基因活化或再表達，從而在維持基因組穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用。其主要機制是在DNA甲基化轉移酶(DNMT)的催化作用下，使胞嘧啶磷酸鳥嘌呤二核苷酸(CpG)5’端C原子與S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供的活性甲基發(fā)生共價結合，形成DNA的甲基化修飾。甲基化的胞嘧啶并不影響基因序列，但使基因表達受到一定影響，是轉錄抑制的主要機制[2]。人體中CpG有兩種存在方式，一種是散在分布的CpG，以甲基化形式存在，成為CpG位點；另一種為富含CG的DNA短序列，稱為CpG島，在正常人體細胞中處于非甲基化狀態(tài)，通常位于基因啟動序列和基因編碼序列中。而在腫瘤組織中，可發(fā)現(xiàn)一些抑癌基因DNA超甲基化或原癌基因低甲基化，直接導致抑癌基因失活或表達沉默，癌基因誘導激活或重新表達，從而誘導癌變發(fā)生[3]。因此，DNA異常甲基化對于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)有著重要意義，可能成為腫瘤篩查的有效分子標志。

2 抑癌基因DNA甲基化與宮頸癌

2.1 DAPK1基因甲基化

死亡相關蛋白激酶1(DAPK1)是γ干擾素介導的凋亡正性調節(jié)因子，DAPK1編碼160kD的鈣調蛋白相關絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是一種與多種細胞死亡相關信號通路相聯(lián)系的抑癌基因[4]。趙先蘭等[5]對132例宮頸病變樣本進行檢測，其中宮頸癌52例、宮頸上皮內瘤變(CIN)60例、正常宮頸鱗狀上皮20例，發(fā)現(xiàn)DAPK1基因甲基化比率在正常組織、CIN和宮頸癌組織中分別為0%、18.3%、65.4%，其甲基化程度與病變程度呈正相關，而DAPK蛋白表達與病變程度呈負相關，提示DAPK啟動子基因甲基化與DAPK基因沉默相關，并且可能參與宮頸癌的發(fā)生。Lattario等[6]對HPV和EB病毒感染的宮頸鱗狀上皮內瘤變中的DAPK甲基化異常進行分析，其結果顯示DAPK甲基化異常與病毒感染無關，同樣認為DAPK基因啟動子異常甲基化可能參與宮頸癌病變的發(fā)展，并可能成為判斷宮頸癌病變的生物學指標。Sun等[7]對250例宮頸病變組織3個基因進行了甲基化分析，同時利用ROC曲線評估各基因區(qū)分高級別宮頸病變時的作用，結果提示，聯(lián)合MGMT和DAPK1基因甲基化檢測可增加高級別宮頸病變篩查效率。

2.2 Ras相關區(qū)域家族1A基因甲基化

Ras相關區(qū)域家族1A(RASSF1A)被認為是一種抑癌基因，參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其編碼蛋白類似Ras效應蛋白，參與調節(jié)多種細胞凋亡及細胞周期檢測點途徑[8]。RASSF1A啟動子CpG島異常甲基化改變使該基因沉默，從而導致RASSF1A功能減弱或缺失，這種表觀遺傳機制也被認為是腫瘤發(fā)生機制之一[8-9]。目前研究發(fā)現(xiàn)，RASSF1A高頻率的甲基化異常在多種惡性腫瘤中均有發(fā)生，其中包括乳腺癌、肺癌、消化系統(tǒng)腫瘤、膀胱癌、前列腺癌等，但其導致腫瘤發(fā)生的具體機制尚不明確，可能與RASSF1A基因沉默，從而影響細胞周期進展、抑制促調亡等作用[9]。Pan等[10]檢測65例宮頸鱗癌樣本和40例正常宮頸組織樣本RASSF1A基因啟動子甲基化情況，其甲基化率分別為20%和0%。Cohen等[11]研究發(fā)現(xiàn)，宮頸腺癌RASSF1A基因甲基化程度(45%)高于宮頸鱗癌(0%)。Kang等[12]的研究也報道了相似結果。由于宮頸鱗癌中RASSF1A基因甲基化程度在各研究中表現(xiàn)不同，而在宮頸腺癌中呈現(xiàn)高頻率甲基化，因此，RASSF1A基因異常甲基化可能作為判斷宮頸腺癌發(fā)生的分子標志。

2.3 細胞黏附分子1基因甲基化

細胞黏附分子1(CADM1)又稱為肺癌腫瘤抑制因子1(TSLC1)，主要發(fā)揮維持細胞間粘附穩(wěn)定以及細胞骨架構建的功能。該基因位于染色體11q23.2中，作為一種抑癌基因，其轉錄沉默導致其蛋白表達下降與肺癌、肝細胞癌等多種腫瘤發(fā)生有關[13]。Overmeer等[14]研究發(fā)現(xiàn)，CADM1基因甲基化頻率與宮頸病變程度成正相關，在正常宮頸組織中為5%，CINⅢ樣本中為30%，宮頸鱗癌組織樣本為83%，但CADM1蛋白表達卻隨宮頸病變程度增加而降低，表明CADM1基因啟動子甲基化導致其基因沉默，同時CADM1基因異常甲基化可能與宮頸癌發(fā)生有密切聯(lián)系。有研究發(fā)現(xiàn)，CADM1與MAL基因甲基化異常提高了高級別宮頸病變的檢出率，提示存在CIN治療后再發(fā)高級別病變的風險[15-16]。研究表明感染高危型HPV婦女聯(lián)合應用CADM1和MAL基因甲基化檢測可以作為宮頸癌篩查的另一種方法。

2.4 配對盒家族基因1基因甲基化

配對盒家族基因1(PAX1)是轉錄因子配對盒家族成員之一，該基因在胚胎形成和脊柱發(fā)育過程中起重要作用，同時在卵巢癌和宮頸癌中，PAX1因甲基化修飾沉默，提示其可能是一種抑癌基因。2008年，Lai等[17]首先發(fā)現(xiàn)宮頸癌中PAX1甲基化，宮頸鱗癌組織PAX1基因甲基化異常頻率為94.4%，而正常宮頸細胞為0%。該研究同時指出，單獨應用PAX1基因甲基化檢測作為篩查指標，其特異性為99%，聯(lián)合應用HPV檢測和PAX1基因甲基化檢測臨床篩查敏感性從66%提高為80%。因此，PAX1基因甲基化檢測在宮頸癌早期篩查中具有重要意義。隨后，Huang等[18]檢測宮頸癌旁組織和遠隔組織PAX1基因甲基化程度，其中82%癌旁正常組織存在PAX1基因的甲基化，只有40%遠隔組織發(fā)生甲基化，說明PAX1基因甲基化可能隨病變部位存在區(qū)域分布。Nikolaidis等[19]對將PAX1最為篩查指標的數(shù)據(jù)進行meta分析，診斷CINⅡ以上病變時其敏感性與特異性分別為0.66和0.92，而診斷CINⅢ以上病變時其敏感性與特異性分別為0.77和0.92。該分析提示，PAX1甲基化檢測可能成為提高篩查宮頸病變特異性的有效方法。

3 HPV DNA甲基化與宮頸癌

HPV一種常見的人感染病原體，其高危型HPV感染與多種腫瘤的發(fā)生密切相關，尤其是宮頸癌[20]。99.7%的宮頸鱗狀細胞癌、94%～100%宮頸腺癌和宮頸腺鱗癌患者可檢測到高危型HPV16、18或31型[21]。持續(xù)HPV感染可導致正常細胞向癌細胞發(fā)生轉變，同時HPV病毒基因向宿主基因整合，也是疾病進展的一個重要步驟[22-23]。病毒基因組整合可誘導E6和E7激活從而抑制細胞抑癌基因p53和Rb的活性；病毒或宿主基因表觀遺傳修飾，影響基因表達。病毒基因上的一些甲基化修飾可能發(fā)生在宮頸癌疾病的各個階段[22，24]。

3.1 HPV16型DNA甲基化

HPV16型持續(xù)感染與宮頸鱗癌的發(fā)生密切相關，研究發(fā)現(xiàn)其整合到宿主基因的DNA存在甲基化異常。Kalantari等[25]對HPV16基因組甲基化特異處理后進行測序，首次觀察到病毒基因L1區(qū)3’末端甲基化異常且與病變進展相關，在宮頸癌樣本中甲基化水平較高，而低級別宮頸病變樣本中甲基化水平較低。Chang等[26]對85例HPV16型陽性的宮頸脫落細胞樣本HPV16 L1開放閱讀框架(ORF)進行甲基化檢測，發(fā)現(xiàn)CINⅢ以上病變患者L1區(qū)ORF甲基化顯著增加，提示該部位基因甲基化異常可能作為宮頸癌及癌前病變診斷的潛在標志。Divya等[27]檢測HPV16基因E6啟動子甲基化水平，發(fā)現(xiàn)病理學診斷正常的宮頸細胞E6甲基化水平明顯高于細胞學異常樣本，提示E6基因去甲基化變化可能與E6基因重新表達相關。Mirabello等[28]學者HPV基因組66個CpG位點甲基化情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)CINⅡ以上樣本中88%CpG位點甲基化異常高于對照組，同時認為HPV16型DNA甲基化水平升高有望成為高級別宮頸病變的篩查指標。但Patel等[29]發(fā)現(xiàn)HPV16甲基化低水平和部分候選宿主基因甲基化高水平與高級別細胞學病變有關。因此，甲基化在宮頸癌的篩查中發(fā)揮的作用還需進一步證明。

3.2 其他型別HPV DNA甲基化

除HPV16型以外，其他型別HPV也存在甲基化異常。Mina等[30]研究104例樣本，分別檢測HPV16型、18型、31型和45型基因L2/L1片段甲基化水平。HPV18型中，宮頸癌病例中80%CpG位點存在甲基化，高于對照組11.9%，其他型別該片段甲基化水平存在同樣趨勢變化，該基因甲基化率隨宮頸病變程度增加而升高。Turan等[31]同樣證明了HPV18型基因在宮頸癌中存在高度甲基化，而無臨床癥狀的感染者中表現(xiàn)為低甲基化水平或無甲基化。綜上所述，研究者認為HPV DNA甲基化檢測可能作為篩查或預測宮頸癌的生物學標志。

4 結論與展望

宮頸癌是危害婦女健康主要疾病之一，而宮頸癌的篩查和早期診斷則是宮頸癌防治的有效手段。目前大量研究表明，抑癌基因或病毒基因甲基化水平異常可導致基因表達水平降低或缺失，從而使疾病保護因素丟失，促進腫瘤發(fā)生。宮頸癌中普遍存在的基因甲基化異?？蔀閷m頸癌的早期診治及治療后監(jiān)測提供新思路?；蚣谆Y查可能成為未來宮頸癌篩查的主流方向，因此尋找特異性好、敏感度高且臨床實踐可行的甲基化生物學標志物將成為以后研究的重點。