郭建軍+曾靜+袁林+邱小忠

摘要：為了獲得多角體包裹的重組豬α干擾素，應(yīng)用Bac-to-Bac昆蟲(chóng)細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，將多角體蛋白基因和編碼成熟豬α干擾素的基因分別構(gòu)建到pFastBac Dual載體的PH、P10啟動(dòng)子下，以多角體蛋白H1 α-螺旋序列為信號(hào)肽。將構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行同源重組，經(jīng)抗性和藍(lán)白斑篩選，獲得重組穿梭質(zhì)粒Bacmid，轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞獲得重組病毒。通過(guò)間接免疫熒光、Western-Blot證明，多角體蛋白與豬α干擾素實(shí)現(xiàn)共表達(dá)，在信號(hào)肽引導(dǎo)下豬α干擾素被包埋進(jìn)多角體；用微量細(xì)胞病變抑制法檢測(cè)顯示，多角體包裹的豬α干擾素有抗病毒活性，效價(jià)達(dá)到5億U/mg以上。應(yīng)用在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的多角體包裹型豬α干擾素，在臨床上為豬病毒性疾病的防治與治療奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬干擾素；多角體；桿狀病毒表達(dá)；抗病毒活性

中圖分類號(hào)： Q786文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）23-0041-04

是人和動(dòng)物細(xì)胞受到特定干擾素誘生劑刺激后，產(chǎn)生的一種具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種功能的細(xì)胞因子[1-2]，是現(xiàn)今最理想的一種抗病毒生物制劑[3]。豬α干擾素（porcine interferon，簡(jiǎn)稱PoIFNα）屬于干擾素Ⅰ型，機(jī)體的多種體細(xì)胞受病毒感染時(shí)均可產(chǎn)生豬α干擾素，具有較強(qiáng)的抗病毒作用[4-5]。PoIFNα基因全長(zhǎng)570 bp，編碼含189個(gè)氨基酸殘基的前體蛋白，其中前23個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，其后的166個(gè)氨基酸為成熟的豬α干擾素蛋白[1-2]。豬α干擾素主要由單核細(xì)胞產(chǎn)生，有多個(gè)亞型，各亞型結(jié)構(gòu)相似，其活體形式為單體。大量試驗(yàn)表明，豬α干擾素對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒[6-7]、口蹄疫病毒[8]和豬傳染性胃腸炎病毒[9]等具有抑制作用。

多角體是由同源結(jié)合的多角體蛋白分子三聚體相互作用組裝成的致密蛋白晶體形成的，多角體能夠有效保護(hù)包埋的異源蛋白免受外界物理和生物化學(xué)作用的降解[10-11]，保持異源蛋白的穩(wěn)定性和生物學(xué)功能，使其具有抗輻射、抗高溫、持久緩釋等作用[12]。Ikeda等將目的蛋白基因與多角體蛋白基因共表達(dá)，且目的蛋白被包埋進(jìn)多角體蛋白內(nèi)[13]；在不良環(huán)境刺激下，受多角體保護(hù)的外源蛋白在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持活性。Mori等利用多角體蛋白將成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子Ⅱ固定入多角體中并成功檢測(cè)了其穩(wěn)定性和生物活性[14]。

利用昆蟲(chóng)病毒Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)，以多角體蛋白氨基端的H1 α-螺旋序列作為多角體蛋白識(shí)別信號(hào)序列與豬α干擾素融合，將多角體蛋白基因和含豬α干擾素融合基因分別構(gòu)建到pFastBac Dual載體的PH、P10啟動(dòng)子下，實(shí)現(xiàn)多角體蛋白與豬α干擾素共表達(dá)，在信號(hào)肽引導(dǎo)下自我組裝，將豬α干擾素包埋入多角體內(nèi)，以期獲得高效、穩(wěn)定、廣譜抗病毒活性的多角體包裹型干擾素制劑，為豬病毒性疾病的防治與治療提供新的解決方案。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1質(zhì)粒和宿主菌多角體基因polyh和豬干擾素PoIFNα完整基因連接在pUC57載體上的克隆質(zhì)粒，由江西省生物化工工程技術(shù)中心保存；桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual，購(gòu)自Invitrogen公司；大腸桿菌DH5α、DH10BacTM，由江西省科學(xué)院微生物研究所分子生物學(xué)研究室保存。

1.1.2試劑限制性內(nèi)切酶為Fermentas公司產(chǎn)品；高保真DNA聚合酶、dNTPs、DNA凝膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶、MiniBest Bacterial Genomic DNA Extraction Kit等，購(gòu)自TaKaRa公司；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。鼠抗豬干擾素α一抗為Santa Cruz公司的產(chǎn)品，異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自Sigma公司。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量marker，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.1.3細(xì)胞和病毒Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞、Vero細(xì)胞和水皰性口炎病毒（VSV）-綠色熒光蛋白（GFP）（能表達(dá)GFP的重組水皰性口炎病毒），由浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病病原學(xué)與免疫控制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室保存。

Sf 9細(xì)胞由筆者所在研究室繼代保存。用Gracés+10%胎牛血清（FBS）于28 ℃培養(yǎng)；Gracés培養(yǎng)基、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin Reagent和優(yōu)級(jí)胎牛血清，購(gòu)自GiBCO公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1共表達(dá)轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建以GenBank中已發(fā)表的多角體基因polyh（登錄號(hào)：GQ924589）為基礎(chǔ)，在上、下游引物中分別添加BamHⅠ、NotⅠ位點(diǎn)，由上海捷瑞生物工程有限公司合成并插入pUC57載體形成質(zhì)粒pUC57-polyh。用BamHⅠ/NotⅠ雙酶切將polyh基因從pUC57載體上切下來(lái)，經(jīng)過(guò)膠回收純化，構(gòu)建到pFastBacDual載體PH啟動(dòng)子下游相應(yīng)的位點(diǎn)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，獲得多角體表達(dá)載體pPH。

以GenBank中已發(fā)表的豬α干擾素（登錄號(hào)：ABB51633）為基礎(chǔ)，對(duì)原始序列的GC含量、限制性內(nèi)切酶和密碼子偏好性等方面進(jìn)行優(yōu)化，并在優(yōu)化后的基因序列的5′端加入XhoⅠ位點(diǎn)、H1信號(hào)肽和柔性連接肽kozak序列，3′端加入KpnⅠ位點(diǎn)，然后由上海捷瑞生物工程有限公司合成并插入pUC57載體形成質(zhì)粒pUC57-PoIFNα。將H1-PoIFNα片段用XhoⅠ/KpnⅠ從pUC57上酶切下來(lái)，經(jīng)過(guò)膠回收純化，構(gòu)建到pPH載體P10啟動(dòng)子下游相應(yīng)的位點(diǎn)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序驗(yàn)證，獲得多角體基因polyh與豬α干擾素基因PoIFNα共表達(dá)轉(zhuǎn)移載體 pPH-PoIFNα。endprint

1.2.2表達(dá)rPoIFNα重組桿狀病毒的構(gòu)建與鑒定利用AcMNPV Bac-to-Bac系統(tǒng)，根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)構(gòu)建重組桿狀病毒質(zhì)粒（簡(jiǎn)稱Bacmid，Invitrogen公司）：分別將共表達(dá)轉(zhuǎn)移載體pPH-PoIFNα和多角體表達(dá)載體pPH轉(zhuǎn)化E.coli DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞，將菌液涂于含有X-gal（40 μg/mL）、IPTG（24 μg/mL）、卡那霉素（50 μg/mL）、慶大霉素（100 μg/mL）和四環(huán)素（30 μg/mL）的培養(yǎng)基平板上，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。采用Cellfectin Reagent將rBacmid-polyh-PoIFNα轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)病變，提取重組桿狀病毒基因組DNA，用M13引物（M13-F：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′；M13-R：5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增特異性片段，鑒定重組桿狀病毒。

1.2.3間接免疫熒光檢測(cè)rPoIFNα的表達(dá)用鑒定正確的穿梭質(zhì)粒rBacmid-polyh-PoIFNα接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，28 ℃培養(yǎng)72 h，至出現(xiàn)形態(tài)病變時(shí)，收獲細(xì)胞，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌后，將懸液滴于載玻片上，自然干燥，用預(yù)冷的丙酮-乙醇（3 ∶2）固定5 min。以鼠抗PoIFNα抗體（1 ∶2 500）作一抗，用FITC標(biāo)記的羊抗鼠抗體（1 ∶250）作二抗，用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。同時(shí)以rBacmid-polyh感染的細(xì)胞作對(duì)照。

1.2.4十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）和Western Blot檢測(cè)rPoIFNα的表達(dá)用上述rBacmid-polyh-PoIFNα接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，用30 mL PBS懸浮后用超聲波破碎，15 000 r/min離心收集多角體。將Percoll與PBS按9 ∶1的體積比混合，調(diào)節(jié)pH值至7.2，12 000 r/min 離心20 min收集純凈的多角體。最后將純化的多角體懸浮于含有0.1% SDS的0.01 mmol/L PBS緩沖液（pH值7.2）中，室溫放置5 min，然后用PBS洗滌2次得到最終純化的多角體。

對(duì)上述純化的多角體進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，用含10%脫脂乳的PBST封閉過(guò)夜，以鼠抗pIFN-α（1 ∶500）作為一抗，作用2 h，用PBST洗滌，后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1 ∶2 500）作二抗，作用1 h，用二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒檢測(cè)。

1.2.5豬α干擾素的抗病毒活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[4-5]的方法，在Vero/VSV·GFP系統(tǒng)上采用微量細(xì)胞病變抑制法測(cè)定多角體包裹的豬α干擾素的抗病毒活性。熒光倒置顯微鏡下觀察GFP表達(dá)及病毒感染復(fù)制情況。以VSV-GFP病毒對(duì)照組細(xì)胞完全出現(xiàn)病變（即熒光數(shù)量為100%）為標(biāo)準(zhǔn)判定干擾素抗病毒活性，將能抑制50%細(xì)胞病變的樣品最高稀釋度定義為1個(gè)抗病毒活性單位。

2結(jié)果與分析

2.1多角體與PoIFNα共表達(dá)轉(zhuǎn)移載體pPH-PoIFNα的構(gòu)建

對(duì)重組質(zhì)粒pPH-PoIFNα用BamHⅠ/NotⅠ、XhoⅠ/KpnⅠ進(jìn)行酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，酶切產(chǎn)物小片段與預(yù)期大小相符，大片段與載體大小相符，詳見(jiàn)如圖1。結(jié)果表明，多角體蛋白基因插入到載體pFastBac Dual質(zhì)粒PH啟動(dòng)子下的BamHⅠ和NotⅠ之間；豬α干擾素基因已成功插入到載體pFastBac Dual質(zhì)粒P10啟動(dòng)子的XhoⅠ和KpnⅠ之間。酶切鑒定正確后，對(duì)相應(yīng)質(zhì)粒進(jìn)行核酸測(cè)序。

用MegAlign程序比對(duì)表明，設(shè)計(jì)在豬α干擾素蛋白N端的融合H1信號(hào)肽和柔性連接肽kozak序列組成PoIFNα基因及多角體蛋白基因序列與測(cè)序結(jié)果序列完全正確，且讀碼框正確，表明多角體基因polyh與豬α干擾素基因PoIFNα共表達(dá)轉(zhuǎn)移載體pPH-PoIFNα構(gòu)建成功。

2.2豬α干擾素在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)

用pPH-PoIFNα質(zhì)粒轉(zhuǎn)化AcMNPV Bac-to-Bac系統(tǒng)的E.coli DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞，得到同時(shí)表達(dá)polyh、PoIFNα基因的重組rBacmid-polyh-PoIFNα。rBacmid-polyh-PoIFNα用M13F、M13R引物進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序比對(duì)分析，表明豬α干擾素PoIFNα基因片段插入至正確位置。

用重組子rBacmid-polyh-PoIFNα轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞48 h后，細(xì)胞出現(xiàn)病變，細(xì)胞內(nèi)充滿顆粒，細(xì)胞附著力減弱，開(kāi)始脫壁上浮并且個(gè)別細(xì)胞解體成顆粒狀物散落至細(xì)胞培養(yǎng)液中，而正常細(xì)胞中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)多角體顆粒。間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示，rBacmid-polyh-PoIFNα感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞顯示強(qiáng)熒光信號(hào)，而以rBacmid-polyh感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞熒光信號(hào)呈陰性（圖2），表明 rPoIFNα在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中獲得表達(dá)。

2.3多角體包裹型豬干擾素的形成及驗(yàn)證

用重組子rBacmid-polyh-PoIFNα轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞48 h后，在顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞多呈圓形，生長(zhǎng)狀態(tài)較差，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可觀察到少量具有強(qiáng)折光性的結(jié)晶顆粒；繼續(xù)培養(yǎng)后，細(xì)胞出現(xiàn)病變，細(xì)胞內(nèi)充滿顆粒，細(xì)胞附著力減弱，開(kāi)始脫壁上浮并且個(gè)別細(xì)胞解體成顆粒狀物散落至細(xì)胞培養(yǎng)液中，而正常細(xì)胞中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)多角體顆粒。

以重組Bacmid感染的細(xì)胞為陰性對(duì)照，用重組 rBacmid-polyh 和重組rBacmid-polyh-PoIFNα感染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9。培養(yǎng)96 h后，收獲感染的細(xì)胞。超聲波破碎細(xì)胞，離心收集多角體。SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，重組rBacmid-polyh和重組rBacmid-polyh-PoIFNα感染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9后，有1條相同大小的條帶，與預(yù)測(cè)的多角體蛋白分子量一致，重組rBacmid-polyh-PoIFNα感染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9后，在19 ku處還出現(xiàn)條帶（圖3-A）。endprint

重組豬干擾素rPoIFNαSDS-PAGE結(jié)果顯示，在19 ku處出現(xiàn)1條帶，轉(zhuǎn)膜后以鼠抗PoIFNα抗體為一抗，用HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作二抗進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。由圖3-B可見(jiàn)，Western Blot檢測(cè)出現(xiàn)1條特異性的抗原-抗體結(jié)合帶，進(jìn)一步驗(yàn)證多角體包埋的蛋白為豬干擾素。

2.4多角體包裹型豬干擾素抗病毒活性的檢測(cè)

用微量細(xì)胞病變抑制法在Vero/VSV·GFP系統(tǒng)上進(jìn)行豬α干擾素抗病毒活性測(cè)定。在倒置熒光顯微鏡下觀察可

見(jiàn)，細(xì)胞對(duì)照組中的細(xì)胞仍完全良好生長(zhǎng)，無(wú)熒光出現(xiàn)，病毒對(duì)照組各孔中幾乎100%細(xì)胞出現(xiàn)熒光，且有細(xì)胞病變。VSV·GFP在Vero細(xì)胞中的繁殖情況與綠色熒光蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，以熒光細(xì)胞數(shù)為病毒對(duì)照孔50%的最高稀釋度為干擾素的效價(jià)?？共《净钚詼y(cè)定結(jié)果表明，多角體包裹型豬α干擾素有較為明顯的抗病毒活性，效價(jià)能達(dá)到 5億U/mg 以上。

3討論

豬PoIFNα作為廣譜抗病毒的細(xì)胞因子，具有高效、無(wú)藥物殘留、無(wú)副作用[1-2]等優(yōu)點(diǎn)，屬于新型蛋白質(zhì)類獸藥，對(duì)多種豬傳染性病毒病具有一定的防治效果，在養(yǎng)豬業(yè)中應(yīng)用前景廣闊[6]。用白細(xì)胞生產(chǎn)干擾素，效果確切，但價(jià)格昂貴。體外表達(dá)PoIFNα進(jìn)行免疫增強(qiáng)作用和抗病毒作用等[5-9]相關(guān)研究已有報(bào)道，利用酵母表達(dá)干擾素，其表達(dá)量極低[15]。至今，人們已用大腸桿菌[16]、酵母[15]、哺乳動(dòng)物細(xì)胞[17]和昆蟲(chóng)桿狀病毒[4-5]等表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)過(guò)豬干擾素，從表達(dá)產(chǎn)物的抗病毒活性來(lái)看，真核表達(dá)產(chǎn)物要好于原核表達(dá)產(chǎn)物。

本研究利用昆蟲(chóng)病毒Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)，以多角體蛋白氨基端的H1 α-螺旋序列作為多角體蛋白識(shí)別信號(hào)序列，信號(hào)序列和豬α干擾素融合，將多角體蛋白基因和含豬α干擾素融合基因分別構(gòu)建到pFastBac Dual載體的PH、P10啟動(dòng)子下，通過(guò)與病毒骨架重組，獲得重組昆蟲(chóng)病毒，多角體蛋白和豬α干擾素在昆蟲(chóng)細(xì)胞中共表達(dá)。預(yù)測(cè)重組蛋白PoIFNα分子量為19 ku，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，在此位置有明顯條帶。Western Blot結(jié)果表明，表達(dá)的豬α干擾素rPoIFNα具有免疫學(xué)活性。

Mori等利用改良的桿狀病毒表達(dá)載體，在培養(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行BmCPV多角體蛋白基因的體外表達(dá)，結(jié)果表明，BmCPV的多角體蛋白可以進(jìn)行自我包裝，在沒(méi)有其他病毒因子的存在下能夠組裝成多角體晶體結(jié)構(gòu)[14]。研究還發(fā)現(xiàn)，多角體不僅可以對(duì)異源病毒粒子進(jìn)行包裝，還可以對(duì)一些異源蛋白進(jìn)行包埋[18]。Ijiri等將蛋白激酶C包裹進(jìn)質(zhì)型多角體中，并發(fā)現(xiàn)包裹型的蛋白激酶C相對(duì)于沒(méi)有經(jīng)過(guò)包裹的蛋白有更強(qiáng)生物學(xué)活性和持續(xù)的藥物緩釋效果[19]。

本研究成功構(gòu)建了共表達(dá)多角體蛋白基因和豬α干擾素基因的重組桿狀病毒。為了實(shí)現(xiàn)豬α干擾素被多角體蛋白包埋，形成多角體包裹的豬α干擾素。筆者在構(gòu)建桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體時(shí)引入以多角體蛋白氨基端的H1 α-螺旋序列作為多角體蛋白識(shí)別信號(hào)序列，將要表達(dá)的豬α干擾素基因連接在H1 α-螺旋序列3′端。PH啟動(dòng)子和P10啟動(dòng)子均是桿狀病毒的極晚期啟動(dòng)子，具有極強(qiáng)的表達(dá)效率，并且相互之間無(wú)干擾性[20]，本研究將多角體蛋白基因和含豬α干擾素融合基因分別構(gòu)建到pFastBac Dual載體的PH啟動(dòng)子和P10啟動(dòng)子下，實(shí)現(xiàn)多角體蛋白與豬α干擾素共表達(dá)，在信號(hào)肽引導(dǎo)自我組裝下將豬α干擾素包埋進(jìn)多角體蛋白內(nèi)，使被多角體包裹的豬α干擾素保持穩(wěn)定的抗病毒活性。

用微量細(xì)胞病變抑制法在Vero/VSV·GFP系統(tǒng)上進(jìn)行豬干擾素抗病毒活性測(cè)定，用VSV·GFP代替野生型VSV具有快速簡(jiǎn)單、靈敏度高的特點(diǎn)[21]?？共《净钚詼y(cè)定結(jié)果表明，多角體包裹豬干擾素α有較為明顯的抗病毒活性，為進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。多角體包裹豬干擾素α結(jié)合了豬干擾素α在抗病毒方面的優(yōu)點(diǎn)及多角體具有的耐酸、抗高溫、持久緩釋等特性的優(yōu)勢(shì)，這些特性很可能使表達(dá)產(chǎn)物在豬病毒性疾病的臨床治療和預(yù)防中發(fā)揮更優(yōu)越的效果。

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