黃靖嫻

摘 要：文章以貝克曼庫爾特有限公司的Optima XPN-100超速離心機為例，主要論述超速離心機相關離心技術，轉頭、容器的選擇因素以及常規(guī)使用維護注意事項，為離心機管理人員及實驗人員提供有用的參考，保障實驗室離心機的正常使用，更好地提升離心機的使用效率。

關鍵詞：超速離心機；離心技術；操作；維護

中圖分類號：Q-33 文獻標志碼：A 文章編號：2095-2945（2018）36-0130-03

Abstract： Taking the Optima XPN-100 ultracentrifuge of Beckman Coulter Co.， Ltd as an exemplar， this paper mainly discusses the centrifuge technology related to the ultracentrifuge， the selection factors of the rotating head and the container， and the matters needing attention in routine use and maintenance. For centrifuge managers and laboratory personnel to provide a useful reference to ensure the normal use of laboratory centrifuges and improve the efficiency of the use of centrifuges.

Keywords： ultracentrifuge； centrifuge technology； operation； maintenance

前言

超速離心機是通過驅(qū)動轉頭高速旋轉產(chǎn)生的離心力場對樣品中不同沉降系數(shù)或浮力密度值的混合物質(zhì)進行快速分離、濃縮和提純的專門設備，最高轉速不低于30，000rpm。超速離心技術廣泛應用于大分子、細胞、細胞器等的分離、純化，是生物化學和分子生物學不可缺少的技術手段[1]。在現(xiàn)代科學研究中，超速離心分離技術日趨重要。

1 超速離心分離技術原理

超速離心分離技術在應用上可分為制備型超速離心和分析型超速離心兩大類。其中制備型超速離心是濃縮與純化各種顆粒的最常用方法，而根據(jù)相對離心力與被離心物質(zhì)間的相互作用方式不同，超速離心法可分為差速離心法和密度梯度離心法[2]。以貝克曼庫爾特有限公司的Optima XPN-100的制備型超速離心機為例，其應用范圍主要有病毒及亞細胞組份分離，蛋白梯度分析，脂蛋白分離，RNA梯度沉淀，質(zhì)粒DNA提純，外泌體純化與分析等。以下將著重論述制備型超速離心技術的應用原理。

1.1 差速沉降離心

差速沉降離心利用離心樣品組分中各顆粒的大小和密度不同而存在沉降速度的差別，經(jīng)一定時間的相對離心力作用，各顆粒先后沉降以達到分離純化的目的，被廣泛應用于樣品的粗提純和濃縮。待分離的顆粒間的沉降系數(shù)差值需足夠大（一般為1到幾個數(shù)量級），否則分離效果不佳[3]。

離心過程中，樣品將分離為兩部分，即沉淀物和上清液。取出上清液后，可加大轉速對上清液進行再離心，從而再次得到沉淀和上清液。如此多次離心處理，可完成樣品中不同顆粒的分離。

此法要注意掌握好離心時間和離心力，時間過長或相對離心力過大都會造成雜質(zhì)顆粒沉降下來，影響分離效果，另外，沉淀于管底的顆粒容易受擠壓而變性失活。所得到的沉淀中會有其他顆粒，不能一次得到純顆粒，需對沉淀進行多次再懸浮和再離心，才能得到較純的顆粒。

差速沉降離心法被廣泛應用于各類生物樣品，如血清、血漿、細胞培養(yǎng)液、尿液、唾液和腦脊液等的分析，是目前外泌體分離方法的“金標準”[4]。

1.2 密度梯度離心

密度梯度離心是把樣品顆粒加入到有密度梯度的惰性介質(zhì)液（如氯化銫、蔗糖等）中，利用顆粒與介質(zhì)的密度值不同，在一定的相對離心力作用下，使樣品中不同種類顆粒分別集中到梯度介質(zhì)中某些特定位置上，最終得到不同的區(qū)帶，從而可以從不同的區(qū)帶中分別收集到純度高的各種顆粒。

本法適用于沉降系數(shù)相差不大的顆粒的分離。如果沉降系數(shù)值相差一個數(shù)量級以上，一般用差速離心法就可以滿足分離需要[5]。

密度梯度離心可一次獲得較純的顆粒，適應范圍也較廣，既能像差速離心法一樣分離具有沉降系數(shù)差的顆粒，又能分離具有一定密度差的顆粒，顆粒也能保持活性，不會擠壓變形。同時，密度梯度離心中惰性梯度介質(zhì)對流性差，從而可以防止分離后的各區(qū)帶間相互混合。但此法需要制備惰性梯度介質(zhì)溶液，離心時間一般較長，操作也相對復雜。

1.2.1 速率區(qū)帶離心（差速區(qū)帶離心法）

用于大小、形狀不同而密度相近的樣品顆粒（即存在一定的沉降系數(shù)差）的分離。

先將介質(zhì)液加入離心管，形成一個連續(xù)的自上而下逐漸增大的密度梯度系列層，再將樣品顆粒加在梯度介質(zhì)液面上，介質(zhì)液常用蔗糖、甘油和Ficoll等，其最大密度一般小于樣品中各組份的密度。在一定時間的相對離心力作用下，顆粒各自以不同的速度沉降，最終在梯度介質(zhì)液形成依據(jù)沉降系數(shù)大小由下至上的區(qū)帶。顆粒的沉降系數(shù)越大，向下沉降越快，呈現(xiàn)的區(qū)帶也越靠近管底部。

此法關鍵在于精確設定離心時間，應在各區(qū)帶間距離達到最大時立即停止離心，不能超過沉降最快的大顆粒到達管底的時間，否則將造成樣品中密度值相近而沉降系數(shù)相遠的顆粒集中在同一區(qū)帶內(nèi)，從而影響分離純化效果[6]。

1.2.2 等密度離心

本法是使樣品中密度不同的各種顆粒分別集中在相應密度的梯度介質(zhì)液中，從而得到分離純化。此法離心效果與顆粒的大小、形狀無關，僅與密度值有關，顆粒間密度差值越大，分離效果越好。離心時間宜長不宜短，通常大于速率區(qū)帶離心法。

離心樣品可加到密度梯度介質(zhì)液的任何位置，在相對離心力的作用下，由于密度值的不同，樣品顆粒在介質(zhì)液中將向下或向上分離，當顆粒到達位置的介質(zhì)液的密度與顆粒的浮力密度相等時，顆粒受力達到平衡，便在此處形成富集條帶。介質(zhì)液有氯化銫、蔗糖、甘油以及Percoll等，可采用連續(xù)梯度，也可是不連續(xù)梯度。采用連續(xù)梯度時，密度梯度介質(zhì)液密度范圍應包括所要分離的各種顆粒的密度；采用不連續(xù)梯度時，先將樣品中的較重的顆粒在可以滿足的離心條件下預先分離除去，再把含有所需顆粒的上清部分置于具有相等密度的不連續(xù)梯度介質(zhì)中離心沉降，密度值低于介質(zhì)的顆粒將上浮而被除去。

等密度離心適用于分離整細胞、亞細胞組分、核酸、蛋白復合體以及病毒等。

2 離心轉頭和容器的選擇

離心機最常配置的轉頭是固定角轉頭和水平轉頭，例如，Optima XPN-100超速離心機固定角轉頭包括Type 19Ti、Type 25Ti、Type 45Ti、Type 70Ti、Type 90Ti、Type 100Ti等10個型號，對應最高轉速從19，000rpm到100，000rpm，水平轉頭則有SW 28Ti、SW 32Ti、SW 41Ti、SW 60Ti等8個型號，對應最高轉速從28，000rpm到60，000rpm，此外還有垂直轉頭、近垂直轉頭、連續(xù)流/區(qū)帶轉頭等可供選擇。轉頭的選擇主要依據(jù)實驗對離心技術的需求。

固定角轉頭離心管與轉子的轉軸之間有一定的角度（通常在14°-45°），選用固定角轉頭以差速沉降離心分離沉降速度有明顯差異的樣品最有效。

水平轉頭在轉頭靜止時，處于轉頭中的離心管中心線與旋轉軸平行，轉頭旋轉時，離心管中心線由平行位置逐漸過渡到與旋轉軸垂直。使用水平轉頭時，顆粒移動距離長，相應的離心時間也較長。樣品做速率區(qū)帶離心（差速區(qū)帶離心）優(yōu)選水平轉頭，等密度離心則兩種轉頭都可選擇。

垂直轉頭的離心管垂直插入轉頭孔內(nèi)，在離心過程中始終與旋轉軸平行，此種轉頭中樣品顆粒移動距離短，相應離心時間也短，主要用于樣品在短時間做等密度離心。

超速離心機有各種式樣的離心容器可供選擇，包括一些特別的離心管，如指封管（OptiSeal）、圓錐形密封管（Konical）、高離心力管（g-max）和快封管（Quick-Seal）等。離心容器的選擇，除要考慮離心容器的式樣、容量外，還需要考慮離心管材質(zhì)與樣品和溶劑的兼容性。常用離心容器的材質(zhì)有聚丙烯（Polypropylene，PP）、聚丙烯和聚乙烯聚合物（Polyallomer，PA）、聚碳酸酯（Polycarbonate，PC）、超凈（Ultra-Clear，UC）、聚乙烯（Polyethylene，PE）、丙酸纖維素（Cellulose Propionate，CP）、不銹鋼（Stainless Steel，SS）。各種材質(zhì)的離心容器化學耐受性、物理性質(zhì)及其適用的消毒滅菌方法詳見表1和表2。

3 操作與維護中應注意事項

Optima XPN-100超速離心機最高轉速可達100，000rpm，最大相對離心力為802，400×g，溫度設定范圍為0-40℃。在操作和維護過程中，需要注意以下事項：（1）生命科學、醫(yī)學領域要離心的樣品往往要求低溫，為避免因離心過程中設備溫度下降較慢而使得樣品活性有所破壞，轉頭與吊管可提前放冰箱預冷，使用時再取出。（2）樣品一定要配平，可兩兩配平（需要精確到千分之一克），對稱放置轉頭或吊管內(nèi)，放入樣品前檢查轉頭或吊管，確保無異物和液體。（3）水平轉頭的吊管要對號入座，全部掛上，并檢查是否掛好。（4）安裝轉頭前，要確保離心腔體無異物和液體；安裝轉頭時，應垂直放在離心軸上，轉頭的蓋子要擰緊。（5）儀器運行后，操作者要等到所設轉速或相對離心力達到設定值，并且趨于穩(wěn)定及運轉正常時才可以離開，同時也要隨時觀察儀器運行情況。（6）使用完畢，取出轉頭并擦試清潔干凈，置于干燥通風處；為讓水汽蒸發(fā)，不要馬上關閉離心機腔體蓋，待腔體恢復近似室溫，用清潔干毛巾擦干腔體，再拉上蓋子。（7）不同型號的轉頭、離心管和吊管等配件要嚴格按照相應的操作說明使用，不能混用錯配。（8）移動轉頭時，注意防止轉頭底部的轉速識別花盤劃花，如果有磨損可能造成轉速上不去，此時應及時更換。（9）定期給真空泵、擴散泵換機油，保證真空系統(tǒng)的正常運行。（10）定期給離心機轉軸和鎖緊螺絲涂抹潤滑脂，更換磨損過度的墊圈；離心機腔體蓋邊緣的O型橡膠圈涂真空脂，防止密封圈老化，并且定期檢查有無變形。

4 結束語

在使用超速離心機時，實驗人員應根據(jù)實驗實際情況選擇合適離心技術、離心轉頭和離心容器等，并嚴格按照超速離心機的操作規(guī)程正確使用，同時也需注重儀器的日常維護保養(yǎng)，保障超速離心機的穩(wěn)定運轉，充分發(fā)揮其使用效率。

參考文獻：

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