人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合兩種填充材料體外生物相容性的比較

侯亮+張揚(yáng)+孫軼峰等

[摘要]目的：對(duì)比膨體聚四氟乙烯（expanded polytetraf luoroethylene，ePTFE）與硅膠的體外生物相容性，為臨床上ePTFE的廣泛應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：采用密度梯度離心法分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs），取第3代細(xì)胞通過(guò)流式檢測(cè)、茜素紅和油紅0染色進(jìn)行干細(xì)胞鑒定，將hMSCs分別與ePTFE和硅膠材料直接作用或與材料浸提液復(fù)合培養(yǎng)，觀(guān)察細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)及增殖情況，計(jì)算細(xì)胞黏附率，CCK-8比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖。結(jié)果：成功分離培養(yǎng)hMSCs，形態(tài)上呈長(zhǎng)梭形、紡錘狀、類(lèi)成纖維細(xì)胞樣；流式檢測(cè)結(jié)果顯示第3代hMSCs高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44（99.5%）、CD90（95.8%），低表達(dá)造血系細(xì)胞表面標(biāo)志物CD45；且茜素紅和油紅0染色陽(yáng)性；ePTFE組細(xì)胞黏附率（92.3%）明顯高于硅膠組細(xì)胞黏附率（76.8%）（P<0.05）；若兩種材料直接作用培養(yǎng)后的細(xì)胞，隨時(shí)間延長(zhǎng)ePTFE組和空白對(duì)照組細(xì)胞活性逐漸增加，仍可保持正常的分裂增殖速度（P>0.05），而硅膠組活細(xì)胞吸光值明顯低于ePTFE組（P<0.05）。結(jié)論：ePTFE體外生物相容性?xún)?yōu)于假體硅膠，較適合作為支架材料應(yīng)用于組織工程的構(gòu)建。

[關(guān)鍵詞]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；聚四氟乙烯；生物相容性；填充材料

[中圖分類(lèi)號(hào)]R318 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2017）07-0048-05

在整形外科領(lǐng)域，通過(guò)移植自體組織或埋置人工材料以達(dá)到治療或美容目的的填充類(lèi)手術(shù)非常多見(jiàn)。填充物的理化性質(zhì)、生物相容性以及體內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定性等問(wèn)題一直以來(lái)備受關(guān)注。自體組織最安全，組織相容性好，且不會(huì)產(chǎn)生排異，但其取之有限，因而并不能滿(mǎn)足所有的手術(shù)需求。臨床目前常用的填充材料主要是固體硅膠，隨著材料工藝水平的發(fā)展，雖然從形態(tài)、質(zhì)地和組織相容性等方面較以往有了較大的改善，但其缺點(diǎn)是不能與機(jī)體建立起血液循環(huán)，后期可在其周?chē)纬梢槐永w維包膜，且偶見(jiàn)硅膠假體的體表透光現(xiàn)象，影響外觀(guān)效果。

膨體聚四氟乙烯（expanded polytetrafluoroethylene，ePTFE）是一種多孔高分子聚合材料，具有不變形、不變質(zhì)、不產(chǎn)生炎性吸收反應(yīng)等特點(diǎn)，可容許細(xì)胞游走及組織向內(nèi)生長(zhǎng)。近年來(lái)ePTFE已普遍應(yīng)用于整形美容外科，尤其是隆鼻、面部凹陷畸形修復(fù)、鼻唇溝過(guò)深美容、耳廓缺陷修復(fù)等。本實(shí)驗(yàn)以人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）作為組織工程細(xì)胞載體，對(duì)比ePTFE和硅膠的體外生物相容性，為臨床上ePTFE的廣泛應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料：膨體聚四氟乙烯（上海索康醫(yī)用材料有限公司，產(chǎn)品注冊(cè)證號(hào)：20143461861）；硅膠（廣州市萬(wàn)和整形材料有限公司，產(chǎn)品注冊(cè)證號(hào)：20143460494）；Ficoll分離液（G&E，瑞士）；DMEM低糖培養(yǎng)基（Hyelone，美國(guó)）；胎牛血清、胰酶（Gibco，美國(guó)）；小鼠抗人CD44-FITC、CD90-FITC、CD45-PE（北京中衫生物技術(shù)有限公司）；人成骨和成脂誘導(dǎo)試劑盒（廣州賽業(yè)生物技術(shù)有限公司）；CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（北京天恩澤生物技術(shù)有限公司）。

1.2儀器設(shè)備：離心管、細(xì)胞培養(yǎng)皿、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning，美國(guó)）；HERAcell 240i全能型CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱、Attune NxT流式細(xì)胞儀、MK3多功能酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）；DMIL LED倒置顯微鏡（Leica，德國(guó)）；5810R高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)）。

1.3標(biāo)本來(lái)源：成人骨髓血樣本1例，取自吉林大學(xué)第二醫(yī)院骨科就診的股骨頸骨折手術(shù)患者，經(jīng)血、尿分析及系統(tǒng)檢查，無(wú)家族遺傳病史及造血系統(tǒng)疾病，肝功能正常，術(shù)前經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)及患者同意，手術(shù)中于骨折斷端取骨髓血5ml，吸入含0.5ml肝素的無(wú)菌針管中備用。

1.4方法

1.4.1 hMSCs分離及傳代培養(yǎng)：采用密度梯度離心法分離hMSCs，將抽取的骨髓血置于Fieoll上層，2000rmp離心20min后，吸取中層乳白色懸浮細(xì)胞，PBS清洗2次，1500rmp離心5min，棄上清。將分離得到的單核細(xì)胞用完全培養(yǎng)基制備成單細(xì)胞懸液，以1×10⁶/ml接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃、5%CO₂孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，每間隔2d換液1次。待貼壁細(xì)胞融合至80%～90%，0.25%胰酶消化，以1：3比例傳代。倒置顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞的生長(zhǎng)及形態(tài)變化。

1.4.2 hMSCs表面標(biāo)志物檢測(cè)：取生長(zhǎng)良好的第3代hMSCs，制成1×10⁶/ml細(xì)胞懸液。PBS洗滌2次，棄上清，加入100 μl PBS液。每管相繼加入小鼠抗人CD44-FITC、CD90-FITC、CD45-PE各20μl。室溫避光孵育20min，PBS洗滌2次，1000rmp離心5min，PBS重懸定容至每管200μl，流式分析儀上樣檢測(cè)。

1.4.3 hMSCs成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)：將第3代hMSCs以每孔1×10⁴/cm²密度接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%～90%之后，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液（10%FBS、0.1μM地塞米松、50μM抗壞血酸、10mMβ-磷酸甘油、1%青鏈霉素），并設(shè)陰性對(duì)照孔（僅加入普通培養(yǎng)基），繼續(xù)培養(yǎng)21d，進(jìn)行茜素紅染色后鏡下觀(guān)察。

1.4.4 hMSCs成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)：將第3代hMSCs以每孔2×10⁸/cm²密度接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%～90%之后，加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液（IO%FBS、1μM地塞米松、10μM胰島素、200μM吲哚美辛、0.5mM IBMX、1%青鏈霉素），并設(shè)陰性對(duì)照孔（僅加入普通培養(yǎng)基），繼續(xù)培養(yǎng)至14d，進(jìn)行油紅0染色后鏡下觀(guān)察。endprint

1.4.5 ePTFE和硅膠材料處理

1.4.5.1原材料直接處理：將ePTFES和硅膠分別置于15ml離心管內(nèi)，用75%乙醇浸泡24h，無(wú)菌PBS沖洗3次，放入紫外操作臺(tái)中照射30min后，無(wú)菌剪刀剪成1mm×2mm×2mm小塊，兩種材料的處理如圖1。

1.4.5.2材料浸提液制備：稱(chēng)取相同質(zhì)量的兩種無(wú)菌材料，置于15ml離心管內(nèi)，依次加入5ml完全培養(yǎng)基，室溫下分別浸泡24h、48h、96h，將獲得的浸提液于4℃保存待用。

1.4.6細(xì)胞黏附率測(cè)定：在24孔板培養(yǎng)板內(nèi)分別植入備用的ePTFE和硅膠各8塊，將濃度為1×10⁸/L的細(xì)胞懸液0.2ml滴加到材料上，靜置4h后，換于另一培養(yǎng)板，加入完全培養(yǎng)基，將原培養(yǎng)板中細(xì)胞消化收集，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，得出流失的細(xì)胞數(shù)；細(xì)胞材料復(fù)合物培養(yǎng)24h后，在培養(yǎng)液中輕輕晃動(dòng)，換于另一培養(yǎng)板，重復(fù)上述步驟，得出未黏附細(xì)胞數(shù)，計(jì)算黏附率。黏附率=（接種細(xì)胞數(shù)流失細(xì)胞數(shù)未黏附細(xì)胞數(shù)）/（接種細(xì)胞數(shù)流失細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.4.7細(xì)胞增殖能力測(cè)定

1.4.7.1原材料直接作用對(duì)hMSCs增殖的影響：將兩種材料分別置于96孔培養(yǎng)板中，并設(shè)不加材料的空白對(duì)照組，每組5個(gè)復(fù)孔。將濃度為2×10³/L細(xì)胞懸液按100μl/孔接種于培養(yǎng)板內(nèi)，置于37℃、5%C02孵育箱內(nèi)培養(yǎng)48h、96h、144h，每孔加入CCK-8 10μl，孵育3h，酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度OD值。以時(shí)間為橫軸，OD值為縱軸繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.4.7.2材料浸提液對(duì)hMSCs增殖的影響：將濃度為5×10³/L細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，加入兩種材料不同時(shí)間收集的浸提液，置于37℃、5%CO₂孵育箱內(nèi)培養(yǎng)48h、96h，每孔加入CCK-8 10μl，孵育3h，酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度OD值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS15.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所得數(shù)據(jù)均以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，各組別之間的比較采用F分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 hMSCs形態(tài)觀(guān)察結(jié)果：倒置顯微鏡觀(guān)察到接種3h后少量細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，但細(xì)胞體積較小，無(wú)突起；培養(yǎng)72h后貼壁細(xì)胞有所增多，呈長(zhǎng)梭形；培養(yǎng)至第7天細(xì)胞增殖分裂加速，為類(lèi)成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，呈漩渦狀集落樣生長(zhǎng)，約在10～12d細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%～90%；傳代后的hMSCs形態(tài)更加均一，排列更加有序，呈魚(yú)群樣、漩渦狀或網(wǎng)狀排列。見(jiàn)圖2。

2.2 hMSCs表面標(biāo)志物檢測(cè)：流式細(xì)胞儀分析顯示間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44和CD90表達(dá)均為陽(yáng)性（99.5%，95.8%），而造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD45表達(dá)為陰性（0.0%），證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為間質(zhì)來(lái)源的干細(xì)胞，見(jiàn)圖3。

2.3 hMSCs成骨、成脂誘導(dǎo)分化鑒定結(jié)果：hMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后由長(zhǎng)梭形逐漸變成多角形或不規(guī)則形，細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)較多細(xì)小顆粒，誘導(dǎo)7d時(shí)細(xì)胞外出現(xiàn)細(xì)小礦化結(jié)節(jié)，21d時(shí)可見(jiàn)明顯鈣結(jié)節(jié)形成，茜素紅染色為陽(yáng)性；hMSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)后胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)許多大小不一的脂滴，誘導(dǎo)2周時(shí)細(xì)胞分化達(dá)高峰，細(xì)胞體積明顯增大，油紅O染色為陽(yáng)性。見(jiàn)圖4。

2.4細(xì)胞黏附率測(cè)定結(jié)果：經(jīng)檢測(cè)，ePTFE每塊材料細(xì)胞黏附率平均達(dá)到92.3%，而硅膠材料細(xì)胞黏附率僅為76.8%，ePTFE對(duì)細(xì)胞的黏附作用優(yōu)于硅膠（P<0.05）。

2.5細(xì)胞增殖測(cè)定結(jié)果：如圖5所示，CCK 8法檢測(cè)兩種材料直接作用培養(yǎng)后的細(xì)胞，隨時(shí)間延長(zhǎng)ePTFE組和空白對(duì)照組細(xì)胞活性逐漸增加，仍可保持正常的分裂增殖速度，兩組之間差異無(wú)顯著性意義（P>0.05），而硅膠組細(xì)胞吸光值明顯低于ePTFE組和空白對(duì)照組（P<0.05）。兩種材料不同時(shí)間收集的浸提液分別作用hMSCs，孵育48h后檢測(cè)結(jié)果顯示各組OD值無(wú)顯著差異（P>0.05），結(jié)果見(jiàn)表1。孵育96h后ePTFE浸泡48h組和硅膠浸泡各組OD值低于空白對(duì)照組（P<0.05），表明材料浸提液對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

3討論

軟組織缺失是整形外科關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題之一，傳統(tǒng)的組織重建方法存在供皮區(qū)缺損、植入物吸收以及異物反應(yīng)產(chǎn)生等缺陷，近年來(lái)干細(xì)胞被認(rèn)為可能是一種新的治療方法。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與脂肪干細(xì)胞是目前組織工程中研究較多的間充質(zhì)干細(xì)胞。二者均能自我更新和多向分化潛能，而且具有取材方便、創(chuàng)傷小、細(xì)胞獲取量大等優(yōu)點(diǎn)，因而成為組織工程研究中的重要種子細(xì)胞之一。雖然這兩種間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性相似，但在成軟骨誘導(dǎo)、血管內(nèi)皮分化等方面，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞比脂肪干細(xì)胞更具有優(yōu)勢(shì)。因此，本研究選取hMSCs作為填充材料生物活性檢測(cè)的細(xì)胞載體。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞支架材料的化學(xué)組成成分、表面理化特性、機(jī)械穩(wěn)定性和三維空間支架結(jié)構(gòu)均是此次考慮的重要因素，而且必須保證移植后細(xì)胞的滲透、足夠的增殖和細(xì)胞在構(gòu)建物中完全分化。目前在組織工程中用作細(xì)胞支架的生物材料主要是一些天然高分子、天然無(wú)機(jī)物和合成高分子。雖然這些支架的生物相容性較好，但仍存在一些不足，如：對(duì)缺損組織的修復(fù)不足，隨時(shí)間增長(zhǎng)材料可逐漸降解等，因此仍需進(jìn)一步研究探索適用于組織工程的載體材料。

ePTFE在整形外科的應(yīng)用已有30多年的歷史。目前報(bào)道多為ePTFE單獨(dú)或是聯(lián)合自體軟骨或其他生物材料應(yīng)用于整形外科的臨床觀(guān)察，而其體內(nèi)外生物相容性的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究鮮有報(bào)道。田田等制備SD大鼠背部全層皮膚至筋膜層損傷模型，觀(guān)察自體移植組、異體移植組和ePTFE實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面愈合情況，發(fā)現(xiàn)ePTFE可引起較小的炎性反應(yīng)及異物反應(yīng)，置于受損創(chuàng)面上未見(jiàn)不良反應(yīng)，提示可將其作為創(chuàng)面覆蓋材料。尹中普等將ePTFE和Ⅰ型膠原聯(lián)合制成的復(fù)合材料應(yīng)用于隆鼻填充物，發(fā)現(xiàn)ePTFE聯(lián)合Ⅰ型膠原復(fù)合材料在細(xì)胞毒性、埋植后的炎性浸潤(rùn)及生物相容性方面均優(yōu)于單純ePTFE。此外，楊柳等觀(guān)察到ePTFE支架材料與人脂肪干細(xì)胞具有良好的體外生物相容性，可作為構(gòu)建脂肪組織工程的細(xì)胞載體。

本次研究成功分離培養(yǎng)出hMSCs，檢測(cè)了第3代細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44和CD90陽(yáng)性表達(dá)，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多系定向誘導(dǎo)分化，進(jìn)一步確認(rèn)實(shí)驗(yàn)所得細(xì)胞具有干細(xì)胞特性。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)倒置顯微鏡觀(guān)察hMSCs黏附、伸展和生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，無(wú)明顯細(xì)胞毒性表現(xiàn)，說(shuō)明該材料對(duì)細(xì)胞有著良好的親和力。CCK-8法測(cè)定活細(xì)胞光吸收值，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ePTFE直接作用hMSCs時(shí)，可增加其成活及增殖，且細(xì)胞增殖效果優(yōu)于硅膠組。由此可見(jiàn)，ePTFE作為整形外科填充材料，在體外生物相容性方面優(yōu)于硅膠假體，為臨床上填充材料的改進(jìn)和廣泛應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。但是，兩種材料的浸提液與hMSCs孵育96h后檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定的影響。作為長(zhǎng)期植入體內(nèi)的生物材料，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的作用時(shí)間遠(yuǎn)不能真實(shí)地反應(yīng)材料的細(xì)胞毒性。合理的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)應(yīng)跟蹤材料降解過(guò)程中降解產(chǎn)物的細(xì)胞毒性。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將跟蹤填充材料在不同降解時(shí)間內(nèi)其降解液的細(xì)胞毒性，建立基于材料降解液的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)方法。

目前，評(píng)價(jià)材料生物相容性的方法主要包括體外細(xì)胞培養(yǎng)法和體內(nèi)埋植法。體外細(xì)胞培養(yǎng)法是將材料的浸提液或者材料本身與某種細(xì)胞進(jìn)行體外的復(fù)合培養(yǎng)，以檢測(cè)細(xì)胞的增殖與功能表達(dá)的情況，這種方法作為材料生物相容性的初級(jí)評(píng)價(jià)方法，可以直接觀(guān)察細(xì)胞與材料復(fù)合生長(zhǎng)的情況。體內(nèi)埋植法是將材料植入體內(nèi)，觀(guān)察宿主對(duì)材料的反應(yīng)，這種方法往往作為后期評(píng)價(jià)材料生物相容性的有效方法，主要觀(guān)察的是材料與周?chē)鷻C(jī)體組織的組織相容性。本次研究采用體外細(xì)胞培養(yǎng)法，直接觀(guān)察了hMscs與兩種填充材料復(fù)合生長(zhǎng)的情況。對(duì)于ePTFE體內(nèi)生物相容性，以及臨床應(yīng)用中所產(chǎn)生的并發(fā)癥及其作用機(jī)理等，有待進(jìn)一步研究探討。endprint