于鵬 王騰 于明超 單洪偉 徐濤 馬甡

摘 要：以前期工作中篩選得到的三株具有水質(zhì)調(diào)控、弧菌抑制等功能的潛在益生菌株（M6、M51、B8）為研究對象，探究其在凡納濱對蝦幼體培育過程中對水體中氨氮和亞硝氮濃度、弧菌和總菌密度以及幼體生長、成活率的影響。試驗設(shè)置空白組、培養(yǎng)基組、M6組、M51組以及B8組。結(jié)果表明：M6組、M51組、B8組幼體成活率明顯高于空白組。在仔蝦時期， M6組、M51組、B8組幼體的成活率分別比空白組提高51.29%、6598%、111.32%。M6組、M51組、B8組對蝦幼體變態(tài)時間整體上要明顯短于空白對照組及培養(yǎng)基組。幼體培育結(jié)束時，各組幼體的體長關(guān)系為：M6組>M51組>B8組>空白組>培養(yǎng)基組。在試驗中期M6組、M51組、B8組水體中的氨氮濃度顯著低于空白組（P<0.05）；在試驗前中期，M6組、M51組、B8組水體中亞硝氮濃度顯著低于空白組（P<0.05）。M6組、M51組、B8組水體中總菌的數(shù)量高于空白組。綜合以上結(jié)果，向水體中直接潑灑菌株M6、M51、B8能夠有效提高苗種培育期間對蝦幼體的成活率，促進(jìn)幼體生長，縮短幼體變態(tài)時間，降低水體中氨氮和亞硝氮的積累。

關(guān)鍵詞：益生菌；幼體培育；生長；水質(zhì)；變態(tài)時間

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）是一種生長迅速，對環(huán)境要求相對較低的對蝦養(yǎng)殖品種，自引進(jìn)中國后發(fā)展迅速，在甲殼類養(yǎng)殖品種中穩(wěn)居產(chǎn)值第一位[1]。我國對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量占據(jù)了全球年產(chǎn)量的四成左右[2]，是名副其實的對蝦養(yǎng)殖大國，因此對于凡納濱對蝦苗種的需求量十分巨大。對蝦苗種質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響對蝦在后期養(yǎng)殖過程中的生長速度和成活率，同時也是整個對蝦養(yǎng)殖過程成敗的重要影響因素之一[3]。

水質(zhì)調(diào)控是對蝦苗種生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，凡納濱對蝦幼體對水質(zhì)尤其是水體中氨氮和亞硝氮濃度的要求較高，水體中氨氮和亞硝氮濃度過高會引起幼體的大量死亡[4-6]。此外，弧菌病是當(dāng)前凡納濱對蝦苗種產(chǎn)業(yè)面臨的一個很嚴(yán)重的問題，致病弧菌的胞外產(chǎn)物中包含大量的蛋白酶，從而使機體組織發(fā)生溶解，引起對蝦及幼體產(chǎn)生各種病癥，嚴(yán)重時甚至造成對蝦及幼體大量死亡[7]。并且弧菌病具有爆發(fā)迅速、致死率高、容易傳染等發(fā)病特點[8-9]，每年弧菌病給苗種行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。隨著水產(chǎn)品藥殘問題的曝光，過去大量使用的抗生素等化學(xué)藥品被國家明令禁止，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)面臨著巨大的壓力，水產(chǎn)養(yǎng)殖必須要找到一條可持續(xù)發(fā)展的健康養(yǎng)殖道路。特別是苗種產(chǎn)業(yè)，在不使用抗生素等違禁化學(xué)藥品的前提下，如何調(diào)節(jié)好水質(zhì)、抑制致病菌的生長、提高凡納濱對蝦苗種的成活率與質(zhì)量成為了亟需解決的問題。

益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究起步較晚，直到1986年益生菌才第一次應(yīng)用到水產(chǎn)領(lǐng)域，但發(fā)展迅速[10]，從益生菌入手解決水質(zhì)調(diào)控、病原控制等已經(jīng)成為當(dāng)今水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用領(lǐng)域的研究熱點。益生菌可以通過與病原爭奪黏附位點[11]、分泌胞外酶[12]、干擾致病菌群體感應(yīng)[13]等機理實現(xiàn)調(diào)節(jié)水質(zhì)、抑制致病菌的生長、提高宿主免疫機能、抗病毒等功能[14]。目前，在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的益生菌種類包括芽孢桿菌[15]、乳酸菌[16]、氣單胞菌[17]、假單胞菌[18]、交替單胞菌[19]、酵母菌[20]等，然而還有很多其他種類功能菌有待進(jìn)一步開發(fā)。

該試驗以前期工作中篩選得到的三株具有水質(zhì)調(diào)控、弧菌抑制功能的潛在益生菌（M6、M51、B8）為研究對象，采用向水體直接潑灑菌液的方法，探究其在凡納濱對蝦幼體培育過程中對水體中氨氮和亞硝氮濃度、總菌和弧菌密度以及幼體生長、成活率的影響。此外，該試驗首次將麥?zhǔn)辖惶鎲伟ˋlteromonas macleodii）應(yīng)用于凡納濱對蝦的幼體培育過程，為今后其他潛在益生菌種類的開發(fā)及在對蝦幼體培育過程中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及培養(yǎng)條件

該試驗所選用的三株潛在益生菌 （M6、M51、B8）均來自中國海洋大學(xué)甲殼動物養(yǎng)殖技術(shù)研究室，其中M6 和B8為芽孢桿菌屬細(xì)菌，M51為麥?zhǔn)辖惶鎲伟?。三株潛在益生菌培養(yǎng)所采用的液體培養(yǎng)基成份如下：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，海水1 L，pH 7.2～7.4；固體培養(yǎng)基成分如下：蛋白胨5 g，酵母膏1 g，瓊脂粉20 g，海水1 L，pH 7.2～7.4。在無菌條件下將三株細(xì)菌用接種環(huán)接至盛有50 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于搖床（30 ℃）培養(yǎng)24 h，備用。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 試驗條件 以150 L塑料白桶為養(yǎng)殖容器，試驗初期每個桶里放海水70 L，并放無節(jié)幼體30 000尾，試驗過程中水體體積逐漸增加，最終每桶水體體積為110 L，在試驗第11天換水30%，其余時間不換水。隨著幼體的不斷發(fā)育，先后向幼體投喂適量的海鏈藻和角毛藻、輪蟲、鹵蟲等生物餌料并搭配人工配合飼料。該試驗所用海水、凡納濱對蝦無節(jié)幼體及各種生物餌料與配合飼料均由青島海壬水產(chǎn)種業(yè)科技有限公司提供。

1.2.2 試驗分組 試驗共設(shè)置空白對照組、培養(yǎng)基組、M6組、M51組、B8組5個試驗組，其中，空白對照組不加任何細(xì)菌及培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組每天向水體中潑灑10 mL液體培養(yǎng)基，M6組、M51組、B8組每天潑灑培養(yǎng)好的菌液10 mL，使相應(yīng)細(xì)菌在水體中的濃度維持在105cfu/mL左右，每個試驗組設(shè)置4個平行。

1.3 檢測指標(biāo)及測定方法

幼體生長及存活：記錄對蝦幼體從溞狀幼體變態(tài)到仔蝦的整個過程中各個時期的變態(tài)時間，在無節(jié)幼體、ZⅡ、MⅡ、P2時對每個試驗桶里的對蝦幼體進(jìn)行計數(shù)并計算成活率，并在P4時測量每組對蝦幼體體長。成活率的測定在保證無光線照射育苗水體的條件下進(jìn)行，用燒杯量取一定的水體進(jìn)行點數(shù)，以防幼體因為趨光性在水體中分布不均勻。

水質(zhì)檢測：每隔一天檢測水質(zhì)情況，主要包括水體中的氨氮濃度以及亞硝氮的濃度，氨氮濃度的測定采用次溴酸鈉氧化法，亞硝氮濃度的測定采用重氮-偶氮光度法。endprint

細(xì)菌檢測：每天檢測水體中弧菌與總菌的數(shù)量變化，將水樣稀釋至適宜倍數(shù)后涂板，30 ℃條件下培養(yǎng)24 h后記錄菌落的數(shù)量，乘以相應(yīng)的倍數(shù)后即每毫升水樣中的細(xì)菌數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析：

試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示，并用SPSS17.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan多重比較和顯著性方差分析，P<0.05表示為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 對蝦幼體的成活率、變態(tài)時間及體長

各試驗組幼體不同時期成活率如圖1所示。在整個幼體培育過程中，空白組幼體成活率呈現(xiàn)直線下降的趨勢，且在各時期低于其他各組。從無節(jié)幼體發(fā)育到溞狀幼體期時，各組對蝦幼體均呈現(xiàn)下降趨勢；在糠蝦幼體培育時，M6組、M51組、培養(yǎng)基組的對蝦幼體成活率均保持平穩(wěn)或者緩慢下降的趨勢，且M6組、M51組、B8組和培養(yǎng)基組對蝦幼體的成活率顯著高于空白對照組（P<0.05）；在仔蝦期時，M6組、M51組、B8組與培養(yǎng)基組的幼體成活率分別比空白對照組提高了51.29%、65.98%、111.32%、96.86%，B8組與培養(yǎng)基組對蝦幼體的成活率顯著高于空白組（P<0.05）。

各試驗組幼體不同時期變態(tài)時間如圖2表示。在ZⅠ變ZⅡ、ZⅢ變MⅠ、MⅠ變MⅡ、MⅡ變MⅢ時，M6組、M51組、B8組的對蝦幼體變態(tài)時間明顯比空白組和培養(yǎng)基組短。在ZⅠ變ZⅡ時，培養(yǎng)基組與空白組的幼體變態(tài)時間相同，M6組、M51組、B8組幼體變態(tài)時間分別比空白組縮短33.33%、16.67%、33.33%；在ZⅢ變MⅠ時，培養(yǎng)基組與空白組的幼體變態(tài)時間相同，M6組、M51組、B8組幼體變態(tài)時間分別比空白組縮短41.18%、41.18%、17.65%；在MⅠ變MⅡ時，培養(yǎng)基組的幼體變態(tài)時間最長，M6組、M51組幼體變態(tài)時間分別比空白組縮短28.57%、14.29%，B8組幼體的變態(tài)時間與空白組相同；MⅡ變MⅢ時，M6組、M51組、B8組與培養(yǎng)基組的幼體變態(tài)時間分別比空白組縮短52.63%、42.11%、5789%、15.79%。

幼體培育結(jié)束時，各試驗組幼體體長如圖3所示?？瞻捉M和培養(yǎng)基組的幼體體長差別不大，分別為0.521 cm、0.520 cm；M6組幼體的體長最大，為0.563 cm，比空白組提高了8.06%。各組別對蝦幼體的體長關(guān)系為：M6組>M51組>B8組>空白組>培養(yǎng)基組。

2.2 水體中氨氮、亞硝氮的濃度變化

各試驗組水體氨氮濃度變化如圖4表示。試驗過程中水體氨氮濃度呈不斷增加的趨勢。試驗前期，空白對照組水體中的氨氮濃度顯著低于M6組、M51組、B8組和培養(yǎng)基組（P<0.05）；在試驗中期時，M6組、M51組、B8組和培養(yǎng)基組水體中的氨氮濃度低于空白對照組，尤其是在第7天時，M6組、M51組、B8組水體中氨氮濃度顯著低于空白對照組（P<0.05）；試驗后期由于水質(zhì)惡化，氨氮和亞硝氮濃度超過危險值，因此采取了換水30%的措施，使水體中的氨氮濃度急劇下降。整個試驗過程中，M6組、M51組、B8組水體中的氨氮濃度無顯著差異（P>0.05）。

水體中亞硝氮濃度變化如圖5所示。試驗過程中亞硝氮濃度呈不斷增加的趨勢。試驗的前中期，M6組、M51組和B8組水體中的亞硝態(tài)濃度低于空白對照組，尤其是試驗第3天和第7天，M6組、M51組、B8組水體中的亞硝氮濃度顯著低于空白組（P<0.05）；到了試驗后期，由于換水導(dǎo)致水體中的亞硝氮濃度急劇下降。

2.3 水體中弧菌和總菌的變化

試驗過程中各組水體中的弧菌數(shù)量如圖6所示。各組弧菌數(shù)量每隔一天會出現(xiàn)一個峰值，M6組和空白組的弧菌數(shù)量較少且波動幅度較小，培養(yǎng)基組弧菌數(shù)量波動幅度最大，在試驗第6天數(shù)量急劇上升，然后又急劇下降。除培養(yǎng)基組，水體中弧菌數(shù)量均維持在0～5×103 cfu/mL之間。培養(yǎng)基組弧菌數(shù)量在0～1.2×105 cfu/mL之間，從整個養(yǎng)殖過程來看，M6組、B8組、空白組水體中的弧菌數(shù)量顯著低于培養(yǎng)基組的弧菌數(shù)量（P<0.05）。

如圖7所示，總菌數(shù)量在幼體培育過程中呈波浪形緩慢上升的趨勢，M6組的總菌數(shù)量維持在1.9×102～9.7×105 cfu/mL之間，M51組總菌數(shù)量維持在1.9×102～4.8×105 cfu/mL之間，B8組總菌數(shù)量維持在1.9×102～3.2×105 cfu/mL之間，培養(yǎng)基組總菌數(shù)量維持在1.9×102～3.0×105 cfu/mL之間，空白組總菌數(shù)量維持在1.9×102～1.3×105 cfu/mL之間?？傮w上空白組的總菌數(shù)量波動幅度較小且顯著低于M6組、M51組、B8組（P<0.05），M6組的總菌數(shù)量顯著高于其他四個組別（P<0.05）。

3 討論

3.1 三株潛在益生菌對對蝦幼體生長與存活的影響

蝦苗的生長發(fā)育與成活率等受養(yǎng)殖密度、水質(zhì)條件、飼喂條件與方式、病害問題、管理模式等多方面的綜合影響[21-22]。此外，有試驗證明，在育苗過程中添加某些益生菌尤其是芽孢桿菌能夠有效促進(jìn)蝦苗的生長發(fā)育并提高其成活率[23]。該試驗所選用的三個潛在益生菌具有類似的功能，三個潛在益生菌組的對蝦幼體成活率、體長等要明顯高于空白組，而且B8組的對蝦幼體的成活率顯著高于空白組，但B8組的對蝦幼體體長與空白組相差不大。從整體上看，B8組水體中的氨氮濃度、亞硝氮濃度與弧菌數(shù)量都處于一個較低的水平，對蝦幼體生活在一個穩(wěn)定且健康的水體中，這可能就是B8組對蝦幼體成活率高、變態(tài)時間短的原因。同樣，由于成活率高，幼體密度大，空間與餌料競爭作用強烈，因此B8組對蝦幼體的個體較小。該試驗選用的一株麥?zhǔn)辖惶鎲伟鶰51在提高幼體體長及成活率、縮短幼體變態(tài)時間等方面表現(xiàn)出較好的效果，但與其余兩株芽孢桿菌相比無明顯優(yōu)勢。

3.2 三株潛在益生菌對水體中的氨氮和亞硝氮濃度的影響endprint

隨著幼體培育密度不斷增大，代謝廢物在水體中累積，導(dǎo)致水體壓力過大，氨氮和亞硝氮濃度過高，嚴(yán)重危害著對蝦幼體的生長發(fā)育。目前，已經(jīng)有許多科研工作者篩選出過具有水質(zhì)凈化功能的益生菌，其中大部分是一些芽孢桿菌[24-27]。該試驗所選用的三株潛在益生菌同樣具有降解水體中氨氮和亞硝氮的功能，但是在試驗前期，空白對照組水體中的氨氮濃度低于三個潛在益生菌組，這可能是由于前期水質(zhì)清潔，當(dāng)添加菌液時，菌液中的氨氮使水體中氨氮濃度升高而造成的。

3.3 三株潛在益生菌對水體中的弧菌和總菌密度的影響

在凡納濱對蝦幼體培育過程中，面對日益加劇的弧菌病，越來越多的人開始從微生態(tài)的角度去探討解決弧菌病的辦法，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)使用噬菌體可以有效降低由副溶血弧菌引起的對蝦死亡率[28]。該試驗在對蝦幼體培育過程中直接向水體中潑灑菌液，發(fā)現(xiàn)弧菌數(shù)量并沒有少于空白組?？赡苁怯捎诩尤氲募?xì)菌濃度過低造成了這種結(jié)果，該試驗所采用的潛在益生菌濃度為105 cfu/mL，Zokaeifar等曾發(fā)現(xiàn)向水體中潑灑枯草芽孢桿菌并且使其濃度維持在108 cfu/mL能有效降低由哈維氏弧菌引起的對蝦死亡率[29]。通過總菌數(shù)量的變化可以看出三個潛在益生菌組水體中的細(xì)菌數(shù)量明顯高于空白組，尤其是M6組，這說明向水體中添加的潛在益生菌能夠在水體中存活。

4 總結(jié)

總體來說，該試驗選用的三株潛在益生菌（M6、M51、B8）在促進(jìn)凡納濱對蝦幼體的生長發(fā)育，縮短變態(tài)時間，提高幼體成活率，降解水體中的氨氮和亞硝氮方面有很好的效果，可作為功能菌株應(yīng)用于對蝦幼體培育過程。

致謝：感謝青島海壬水產(chǎn)種業(yè)科技有限公司為本試驗所提供的試驗條件、住宿等便利。

參考文獻(xiàn)：

[1]

趙永鋒，宋遷紅.南美白對蝦養(yǎng)殖概況及病害防控措施[J].科學(xué)養(yǎng)魚，2014（7）：13-17.

[2] 周井娟.中國對蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展軌跡及技術(shù)變遷[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2016，32（8）：22-29.

[3] 方楊建.凡納濱對蝦苗種挑選重要性及挑選運輸技術(shù)[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖，2016，37（3）：19-20.

[4] 丁美麗，林林，李光友，等.有機污染對中國對蝦體內(nèi)外環(huán)境影響的研究[J].海洋與湖沼，1997（1）：7-12.

[5] 姜令緒，潘魯青，肖國強，等.氨氮對凡納濱對蝦免疫指標(biāo)的影響[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2004，11（6）：537-541.

[6] 方金龍，王元，李新蒼.氨氮和亞硝基氮共同脅迫對凡納濱對蝦感染W(wǎng)SSV的影響[J].海洋漁業(yè)，2017，39（1）：85.

[7] 胡超群，陶保華.綜述：對蝦弧菌病及其免疫預(yù)防的研究進(jìn)展[J].熱帶海洋，2000（3）：84-94.

[8] 林禾杰，王祖薇，胡裕松，等.弧菌病—對蝦養(yǎng)殖重大災(zāi)害的防治[J].當(dāng)代水產(chǎn)，2013，38（3）：66-68.

[9] Aguirre-Guzmán G，Sánchez-Martínez J G，Pérez-Casta eda R，et al.Pathogenicity and infection route of Vibrio parahaemolyticus in American white shrimp，Litopenaeus vannamei[J].Journal of the world aquaculture society，2010，41（3）：464-470.

[10] Gatesoupe F.J.The use of probiotics in aquaculture[J].Aquaculture，1999，180（1）：147-165.

[11] Olsson J C，Westerdahl A，Conway P L，et al.Intestinal colonization potential of turbot （Scophthalmus maximus） and dab （Limanda limanda） associated bacteria with inhibitory effects against Vibrio anguillarum[J].Applied and Environmental Microbiology，1992，58（2）：551-556.

[12] Pandiyan P，Balaraman D，Thirunavukkarasu R，et al.Probiotics in aquaculture[J].Drug Invention Today，2013，5（1）：55-59.

[13] Defoirdt T，Thanh L D，Van Delsen B，et al.N-acylhomoserine lactone-degrading Bacillus strains isolated from aquaculture animals[J].Aquaculture，2011，311（1）：258-260.

[14] 王亞敏，王印庚.微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的作用機理及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008（ 6）：72-75.

[15] Cutting S M.Bacillus probiotics[J].Food microbiology，2011，28（2）：214-220.

[16] Harikrishnan R，Balasundaram C，Heo M S.Effect of probiotics enriched diet on Paralichthys olivaceus infected with lymphocystis disease virus （LCDV）[J].Fish & Shellfish Immunology，2010，29（5）：868-874.

[17] Nayak S K.Probiotics and immunity：a fish perspective[J].Fish & shellfish immunology，2010，29（1）：2-14.

[18] Fan L，Chen J，Liu Q，et al.Exploration of three heterotrophic nitrifying strains from a tilapia pond for their characteristics of inorganic nitrogen use and application in aquaculture water[J].Journal of bioscience and bioengineering，2015，119（3）：303-309.

[19] Riquelme C，Hayashida G，Araya R，et al.Isolation of a native bacterial strain from the scallop Argopecten purpuratus with inhibitory effects against pathogenic vibrios[J].Journal of Shellfish research，1996，15（2）：369-374.

[20] Pérez-Sánchez T，Ruiz-Zarzuela I，Blas I，et al.Probiotics in aquaculture：a current assessment[J].Reviews in Aquaculture，2014，6（3）：133-146.

[21] 么宗利，王慧，周凱，等.碳酸鹽堿度和pH值對凡納濱對蝦仔蝦存活率的影響[J].生態(tài)學(xué)雜志，2010，29（5）：945-950.endprint