松花粉對(duì)急性汞中毒大鼠肝腎的保護(hù)作用及機(jī)制研究

王 蕾，謝月群，張 和

0 引言

松花粉(PiniPollen)是松科(Pinaceae)植物馬尾松(PinusmassonianaLamb.)、油松(PinustabuliformisCarr.)或同屬數(shù)種植物的干燥花粉[1]，含有豐富的黃酮、微量元素硒、維生素C、維生素E卵磷脂、酶類(lèi)和多種植物激素等生物活性物質(zhì)或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2-3]。研究表明，松花粉具有治療前列腺增生、促進(jìn)鋅的吸收、抗衰老、抗疲勞、保護(hù)心腦血管、降低血脂、提高性功能、保肝等作用[3]。多項(xiàng)小鼠、大鼠實(shí)驗(yàn)從改善學(xué)習(xí)記憶、保護(hù)肝細(xì)胞、保護(hù)腎臟、促血砷排泄、提高抗氧化能力、抑制大腦皮質(zhì)細(xì)胞和腎臟細(xì)胞凋亡、促進(jìn)造血等方面，研究松花粉對(duì)鉛、砷中毒的保護(hù)作用[2,4-9]。

汞及其化合物能通過(guò)多種途徑對(duì)機(jī)體產(chǎn)生以神經(jīng)性、肝臟和腎臟毒性為主的多系統(tǒng)損害[10]。汞污染已成為一個(gè)全球性污染問(wèn)題，隨著汞及其化合物的污染問(wèn)題日益嚴(yán)重，如何預(yù)防及治療汞及其化合物對(duì)機(jī)體的毒性作用顯得極其重要[11]。故研發(fā)安全、有效的汞中毒防治藥物具有深遠(yuǎn)的意義。本文通過(guò)皮下注射HgCl2溶液建立大鼠急性汞中毒模型，研究松花粉對(duì)急性汞中毒的保護(hù)作用和機(jī)制，以期為松花粉預(yù)防和治療急性汞中毒提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)健康SD大鼠50只，雌雄各半，體重(200±20)g (溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。松花粉(南京如來(lái)福生物工程有限公司)用0.5%CMC-Na制成0.2、0.4、0.8 g/mL的混懸液；HgCl2(上海試四赫維化工有限公司)用生理鹽水制成1 mg/mL的溶液。尿素氮(BUN)、尿蛋白、尿乳酸脫氫酶(LDH)、尿堿性磷酸酶(ALP)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)測(cè)試盒(上海朗頓生物科技有限公司)。高速離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠(chǎng))，高速組織勻漿機(jī)(艾卡廣州儀器設(shè)備有限公司)，7700型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司)，680型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組、給藥和樣品采集 50只SPF級(jí)健康SD大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組，染汞模型組，松花粉低、中、高劑量組(2、4、8 g/kg)，每組10只，雌雄各半。正常對(duì)照組大鼠按2.5 mL/kg劑量，皮下注射生理鹽水；其他組大鼠按2.5 mL/kg劑量，皮下注射1 mg/mL HgCl2溶液，連續(xù)2 d，建立急性汞中毒模型[11]。末次染汞后，對(duì)照組和染汞模型組分別按10 mL/kg劑量，灌胃給予0.5% CMC-Na；松花粉低、中、高劑量組(2、4、8 g/kg)分別按10 mL/kg劑量，灌胃給予0.2、0.4、0.8 g/mL的松花粉混懸液；每天早晚各1次，持續(xù)5 d。末次給藥后，將大鼠移入代謝籠中，收集12 h的尿液，用于測(cè)定尿汞、蛋白、LDH和ALP的含量或活性，在此期間停止食物供應(yīng)，但給予自由取用去離子水。尿液收集12 h后，水合氯醛麻醉大鼠，將大鼠以仰臥位固定在手術(shù)操作臺(tái)上，剪開(kāi)腹部皮毛，然后腹主動(dòng)脈取血，靜置1 h，以3 000 r/min離心10 min，分離得到血清，用于測(cè)定血汞、BUN、ALT、AST和TBIL的含量或活性。將大鼠處死，解剖分離得到腎臟和肝臟，準(zhǔn)確稱(chēng)取腎臟和肝臟各1.0 g，分別加入9 mL生理鹽水，在冰浴上制成10%組織勻漿，以3 000 r/min離心10 min，獲得上清液，用于測(cè)定肝汞和腎汞及腎臟和肝臟中SOD、GSH-Px、GSH和MDA的含量或活性。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)及方法 肝汞、腎汞、血汞和尿汞的含量通過(guò)7700型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定[12]。BUN、尿蛋白、尿LDH、尿ALP、血清ALT、血清AST和血清TBIL及腎臟和肝臟中SOD、GSH-Px、GSH和MDA的含量或活性均通過(guò)相應(yīng)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 松花粉對(duì)急性汞中毒大鼠肝汞、腎汞、血汞和尿汞含量的影響 由表1可知，與正常對(duì)照組比較，染汞模型組大鼠肝汞、腎汞、血汞和尿汞含量均增加(P<0.01)，表明急性汞中毒模型造模成功。與染汞模型組比較，松花粉組大鼠肝汞、腎汞和血汞含量均降低(P<0.01)，松花粉低、中、高劑量組大鼠尿汞含量增加(P<0.05或P<0.01)，表明松花粉具有清除體內(nèi)汞蓄積的作用。

2.2 松花粉對(duì)急性汞中毒大鼠BUN、尿蛋白、尿LDH和尿ALP含量或活性的影響 由表2可知，與正常對(duì)照組比較，染汞模型組大鼠BUN、尿蛋白、尿LDH和尿ALP含量或活性均增加(P<0.01)，表明急性汞中毒導(dǎo)致了大鼠急性腎損傷。與染汞模型組比較，松花粉低、中、高劑量組大鼠BUN、尿蛋白、尿LDH和尿ALP含量或活性均降低(P<0.05或P<0.01)，表明松花粉對(duì)急性汞中毒誘導(dǎo)的急性腎損傷具有一定的修復(fù)作用。

表1 各組大鼠肝汞、腎汞、血汞、尿汞含量比較

注：與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與染汞模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

表2 各組大鼠BUN、尿蛋白、尿LDH、尿ALP含量或活性比較

注：與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與染汞模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.3 松花粉對(duì)急性汞中毒大鼠血清ALT、AST、TBIL活性的影響 由表3可知，與正常對(duì)照組比較，染汞模型組大鼠血清ALT、AST和TBIL活性均顯著增加(P<0.01)，表明急性汞中毒引起了大鼠急性肝損傷。與染汞模型組比較，松花粉低、中、高劑量組大鼠血清ALT、AST和TBIL活性均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，表明松花粉對(duì)急性汞中毒誘導(dǎo)的急性肝損傷具有一定的修復(fù)作用。

表3 各組大鼠血清ALT、AST、TBIL活性比較

注：與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與染汞模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.4 松花粉對(duì)急性汞中毒大鼠腎臟和肝臟中SOD、GSH-Px、GSH和MDA活性或含量的影響 由表4、表5可知，與正常對(duì)照組比較，染汞模型組大鼠腎臟和肝臟SOD、GSH-Px和GSH活性或含量均降低(P<0.01)，染汞模型組大鼠腎臟和肝臟MDA含量增加(P<0.01)，表明急性汞中毒引起了大鼠肝臟和腎臟的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。與染汞模型組比較，松花粉低、中、高劑量組大鼠腎臟和肝臟SOD、GSH-Px和GSH活性或含量均增加(P<0.05或P<0.01)，松花粉低、中、高劑量組大鼠腎臟和肝臟中的MDA含量降低(P<0.05或P<0.01)，表明松花粉對(duì)急性汞中毒引起的腎臟和肝臟的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷具有一定的修復(fù)作用。

3 討論

HgCl2誘導(dǎo)的急性汞中毒大鼠模型被廣泛用于研發(fā)汞中毒防治藥物，HgCl2經(jīng)皮下注射后迅速分布于各組織，其主要分布于腎臟和肝臟[11,13]。BUN、尿蛋白、尿LDH和尿ALP含量或活性是體現(xiàn)腎功能正常與否的重要指標(biāo)，急性汞中毒可誘導(dǎo)急性腎損傷，進(jìn)而導(dǎo)致BUN、尿蛋白、尿LDH和尿ALP含量或活性升高[11,13]。血清ALT、AST和TBIL活性是體現(xiàn)肝功能正常與否的重要指標(biāo)，急性汞中毒可誘導(dǎo)急性肝損傷，進(jìn)而導(dǎo)致血清ALT、AST和TBIL活性升高[14]。急性汞中毒可誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而損害肝臟和腎臟的正常功能[15]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的重要產(chǎn)物，MDA可能引起細(xì)胞代謝及功能障礙，甚至死亡，其含量與細(xì)胞損傷的程度呈正相關(guān)，因此，測(cè)定MDA含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接反映細(xì)胞損傷的程度[16]。SOD、GSH-Px、GSH能夠抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生，進(jìn)而防止脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)組織的損害[17]。

表4 各組大鼠腎臟SOD、GSH-Px、GSH、MDA活性或含量比較

注：與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與染汞模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

表5 各組大鼠肝臟SOD、GSH-Px、GSH、MDA活性或含量比較

注：與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與染汞模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

研究發(fā)現(xiàn)，大鼠皮下注射HgCl2后，與正常對(duì)照組比較，其肝汞、腎汞、血汞、尿汞、BUN、尿蛋白、尿LDH、尿ALP、血清ALT、血清AST、血清TBIL、腎臟MDA和肝臟MDA含量或活性均顯著升高，腎臟和肝臟SOD、GSH-Px、GSH含量或活性均顯著降低。結(jié)果表明，HgCl2誘導(dǎo)的急性汞中毒大鼠模型造模成功，并且急性汞中毒可引起大鼠腎臟和肝臟的損傷，其機(jī)制可能與HgCl2誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，灌胃給予急性汞中毒大鼠松花粉后，其尿汞含量進(jìn)一步增加，上述其余指標(biāo)均向正常對(duì)照組的數(shù)值變化。結(jié)果表明，松花粉具有清除體內(nèi)汞蓄積、修復(fù)急性汞中毒誘導(dǎo)的急性肝腎損傷的作用，其機(jī)制與抑制脂質(zhì)過(guò)氧化損傷相關(guān)。本研究較全面地研究了松花粉通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化損傷對(duì)急性汞中毒肝腎的保護(hù)作用，但對(duì)于分子生物機(jī)制并無(wú)闡述，進(jìn)一步的研究應(yīng)該從松花粉的具體分離成分入手，研究其藥效，并分析其作用信號(hào)通路。

[1] 衛(wèi)瑩芳,吳啟南,陳隨清,等.中藥鑒定學(xué)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,2010:270.

[2] 仕薇琳,任紫嫣,曹存鳳,等.松花粉對(duì)鉛中毒小鼠學(xué)習(xí)和記憶障礙的改善作用[J].食品科學(xué),2014,35(19):277-279.

[3] 何曉燕,孫雪圓,于智洋.松花粉的有效成分及藥理作用[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,35(9):78-80.

[4] 趙全罡,羅艷紅.松花粉對(duì)砷中毒小鼠肝組織ALT活性的影響[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2012,9(20):2635-2636.

[5] 羅艷紅,黃曉敏,韋文龍,等.松花粉對(duì)砷中毒大鼠的防護(hù)作用[J].右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2007,29(1):24-25.

[6] 韋利英,羅艷紅,羅鳳芬,等.松花粉對(duì)砷中毒小白鼠肝臟RNA含量及其尿酸含量的影響[J].右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,31(2):185-186.

[7] 羅艷紅,韋耀東,王太重,等.松花粉對(duì)砷中毒小鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子和蛋白的影響[J].環(huán)境與健康雜志,2011,28(7):586-588.

[8] 羅艷紅,于沛濤,王太,等.松花粉對(duì)砷中毒小鼠腎臟細(xì)胞凋亡的影響[J].臨床醫(yī)藥實(shí)踐,2010,19(4B):425-426.

[9] 羅鳳芳,羅艷紅,韋利英,等.松花粉對(duì)砷中毒小鼠血象的影響[J].右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,31(1):21-22.

[10]臧琳,姜登東.汞對(duì)人體的危害及其預(yù)防[J].中國(guó)勞動(dòng)防護(hù)用品,1999,(1):36-37.

[11]鄭捷,鄭宇翔,肖鳳霞,等.土茯苓對(duì)急性汞中毒大鼠的保護(hù)作用研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014,20(4):163-166.

[12]李偉東,張志杰,陳逸君,等.電感耦合等離子體光譜法/質(zhì)譜法測(cè)定自然銅不逃跑制品中砷鉛銅鎘汞的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(24):181-186.

[13]鄭光耀,陳茂銓,何玲,等.松針葉綠素-胡蘿卜素軟膏對(duì)汞中毒大鼠防治作用的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2012,23(6):1402-1403.

[14]劉東寬,楊進(jìn).急性汞中毒肝臟損害1例報(bào)告[J].中國(guó)工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2005,18(3):142.

[15]景友玲,王艷蕾,耿菲,等.急性汞中毒與氧化應(yīng)激反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究[J].工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病,2010,36(4):230-233.

[16]王曉綱.白芍總苷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的抑制作用[J].實(shí)用藥物與臨床,2017,20(2):140-143.

[17]Wang HF,Zhong XH,Shi W,et al.Study of malondialdehyde (MDA),superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) activities in chickens infected with avian infectious bronchitis virus[J].Afr J Biotechnol,2011,10(5):9213-9217.