王彬，李霄，馬凰富，祝雨田，馬健雄，王繼升，黨進(jìn)，李海松

男性不育癥是指結(jié)婚1年以上的夫妻，有正常性生活且未采用避孕措施，女方生育能力正常，因男方原因而致不育者。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在全球已婚家庭中，不育夫婦占15%～18%，而其中因男性原因不育者占50%［1］。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于男性不育癥的病因尚不十分明確，目前認(rèn)為常見(jiàn)的病因有精液障礙、生精障礙、精子卵子結(jié)合障礙以及內(nèi)分泌因素，其中以生精障礙最為普遍［2］。男性不育癥引發(fā)了諸如社會(huì)、醫(yī)學(xué)在內(nèi)的很多問(wèn)題，如何尋找解決問(wèn)題的有效方法已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn)話題。男性不育癥以少、弱精子癥最為常見(jiàn)。目前西醫(yī)治療手段主要包括睪酮、絨毛膜促性腺激素等藥物以及輔助生殖技術(shù)等，總體治療效果有局限性。中醫(yī)治療注重整體觀念和辨證論治，在男性不育癥治療方面有一定的優(yōu)勢(shì)，是我國(guó)治療男性不育癥的重要手段［3］。歷代中醫(yī)學(xué)家對(duì)男性不育癥病因、病機(jī)均有所論述，現(xiàn)代藥物研究亦發(fā)現(xiàn)許多補(bǔ)腎中藥及復(fù)方藥物在不育癥治療方面有一定優(yōu)勢(shì)［4］。左歸丸具有補(bǔ)腎精、養(yǎng)精血、化瘀血之功，其治療男性不育癥具有一定的療效［5］。

左歸丸可明顯改善生精障礙大鼠的精液質(zhì)量、附睪肉堿、血清抑制素（INHB）。然而，目前有關(guān)左歸丸對(duì)男性不育癥患者生殖功能方面作用的基礎(chǔ)研究較少，且對(duì)其改善生精功能的機(jī)制尚無(wú)系統(tǒng)研究。因此，本研究在明確左歸丸治療少弱精子型男性不育癥臨床療效基礎(chǔ)上，通過(guò)觀察左歸丸對(duì)少弱精子癥大鼠睪丸干細(xì)胞因子（SCF）及其mRNA表達(dá)的影響，探討其改善生殖功能、治療男性不育癥的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2014年3—4月選取SPF級(jí)SD雄性大鼠36只〔斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供；許可證號(hào)：SCXK(京)2011-0004〕，鼠齡12周，平均體質(zhì)量（280±30）g。在適宜的溫、濕度環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，大鼠自由飲用普通自來(lái)水，食用普通固體飼料，光照10～12 h/d，室溫24～25 ℃，濕度55%～60%。

1.2 藥物與試劑 雷公藤多苷片（安徽新隴海藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：10 mg/片，生產(chǎn)批號(hào)：130801）；左歸丸（河南宛西制藥廠生產(chǎn)，規(guī)格：12袋/盒，9 g/袋，批號(hào)：131209）。將雷公藤多苷片、左歸丸分別研磨成粉末并配制成實(shí)驗(yàn)所需濃度的混懸液，置于4 ℃冰箱保存。免疫組化法試劑：SCF抗體（abcam，ab64677）。

1.3 儀器 光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯，型號(hào)：L340099）；低溫離心機(jī)（Sigma-Aldrich 西格瑪奧德里奇公司3K18）；Sagecreation凝膠成像分析系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）；PCR儀（Applied Biosystems美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，型號(hào)9700）；熒光定量PCR 儀（Roche羅氏，型號(hào) LC480Ⅱ）。

1.4 方法

1.4.1 分組及給藥 將36只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、雷公藤多苷模型組、左歸丸治療組，每組12只。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程 正常組全程給予去離子水灌胃干預(yù)［6］；雷公藤多苷模型組實(shí)驗(yàn)前4周給予雷公藤多苷40 mg·kg-1·d-1造模（少弱精子癥模型），實(shí)驗(yàn)5～8周給予去離子水灌胃干預(yù)［6］；左歸丸治療組實(shí)驗(yàn)前4周給予雷公藤多苷40 mg·kg-1·d-1造模（少弱精子癥模型），實(shí)驗(yàn)5～8周給予左歸丸6 g·kg-1·d-1，實(shí)驗(yàn)共計(jì)8周。

1.4.3 睪丸組織SCF及其mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 飼養(yǎng)8周后，將所有大鼠處死，無(wú)菌留取睪丸組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋切片4 ℃保存。采用免疫組化法檢測(cè)各組大鼠睪丸組織SCF表達(dá)水平，使用IPP 6.0軟件測(cè)定每組SCF陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值即為SCF表達(dá)水平，比較各組大鼠睪丸組織SCF表達(dá)水平；各組大鼠睪丸組織石蠟切片，室溫復(fù)溫30 min；之后將各組睪丸組織石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟置于濕盒中，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH值7.2～7.4）沖洗3次；置于98 ℃的枸櫞酸緩沖液（pH值6.0）中加熱20 min以修復(fù)抗原，室溫冷卻，PBS沖洗3次；滴加20%蛋清孵育30 min，PBS沖洗 3次封閉；滴加 3% H2O2-CH3OH，10 min后PBS沖洗3次；稀釋的一抗（SCF為1: 800）；每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)抗體來(lái)源的IgG作為陰性對(duì)照，其中陰性對(duì)照滴加PBS于睪丸組織切片上，4 ℃冰箱過(guò)夜；室溫復(fù)溫30 min，PBS沖洗3次；加HRP標(biāo)記二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次；加DAB顯色液，室溫下避光反應(yīng)5～10 min，自來(lái)水沖洗2次；用蘇木素進(jìn)行復(fù)染1～3 min，自來(lái)水沖洗15 min，超純水沖洗3 min；常規(guī)進(jìn)行脫水及透明；采用Real-time PCR法檢測(cè)各組大鼠睪丸組織SCF mRNA表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以（x±s）表示，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)后，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠睪丸組織SCF表達(dá)水平比較 3組大鼠睪丸組織SCF表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。左歸丸治療組大鼠睪丸組織SCF表達(dá)水平高于雷公藤多苷模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表1）。

2.2 3組大鼠睪丸組織SCF mRNA表達(dá)水平比較 3組大鼠睪丸組織SCF mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。左歸丸治療組SCF mRNA表達(dá)水平高于雷公藤多苷模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表2、圖1）。

3 討論

SCF及其受體原癌基因蛋白質(zhì)（c-kit）在男性生殖中起重要作用。在性腺軸的控制下，SCF與生精細(xì)胞上的受體c-kit結(jié)合，調(diào)節(jié)生精細(xì)胞的自我更新和增殖，從而產(chǎn)生精子［7］。研究表明，SCF/c-kit可調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞增殖、分化、減數(shù)分裂和細(xì)胞凋亡［8］。并且，SCF既可以促進(jìn)干細(xì)胞分裂［9］，又可以抑制體內(nèi)細(xì)胞凋亡，其對(duì)干細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的調(diào)控作用。研究顯示，SCF與促凋亡因子Bax和抗凋亡因子 Bcl-2具有十分密切的關(guān)系，SCF可以通過(guò)上調(diào)Bcl-2表達(dá)水平，降低Bax表達(dá)水平，發(fā)揮抗凋亡作用［10］。

表1 3組大鼠睪丸組織SCF表達(dá)水平比較（x±s）Table 1 Comparison of the SCF protein expression levels in the testicular tissue between the normal group, TG model group and Zuogui pill treatment group

表2 3組大鼠睪丸組織SCF mRNA表達(dá)水平比較（x ±s）Table 2 Comparison of the SCF mRNA expression levels in the testicular tissue between the normal group, TG model group and Zuogui pill treatment group

圖1 3組睪丸組織SCF mRNA表達(dá)水平電泳圖Figure 1 Electrophoresis analysis of SCF mRNA expression levels in the testicular tissue in 3 groups

不育癥歸屬于中醫(yī)學(xué)“精冷”“精少”等范疇。中醫(yī)學(xué)多認(rèn)為其與腎、心、肝、脾等臟有關(guān)，而腎為先天之本，其與腎臟關(guān)系最為密切。如《黃帝內(nèi)經(jīng)》曰：“丈夫二八腎氣盛，天癸至，精氣溢瀉，陰陽(yáng)和，故能有子……”稟賦不足，腎氣虛弱日久傷陰，精血耗散或陰虛火旺，精液黏稠難化，發(fā)為不育。左歸丸以滋陰補(bǔ)腎、填精益髓為法，主治真陰不足證，出自張景岳的 《景岳全書(shū)》。該方由六味地黃丸化裁而成，方以熟地滋腎填精，大補(bǔ)真陰，為君藥；山茱萸可養(yǎng)肝滋腎，澀精斂汗，山藥補(bǔ)脾益陰滋腎，枸杞補(bǔ)腎益精，龜、鹿二膠以血肉有情之品峻補(bǔ)精髓，皆為臣藥；菟絲子、川牛膝益肝腎、通血脈為佐藥。諸藥合用，共奏補(bǔ)腎精、養(yǎng)精血、化瘀血之功效。全方純補(bǔ)無(wú)泄，體現(xiàn)了張景岳“補(bǔ)陰不利水，利水不補(bǔ)陰，而補(bǔ)陰之法不宜滲”“陽(yáng)中求陰”的思想。臨床上用左歸丸治療腎陰虧虛型的男性少、弱精子癥，可消除遺精滑泄，腰膝酸軟，五心煩熱等癥狀。有研究表明，左歸丸對(duì)于正常小鼠睪丸、精囊腺有增重作用，能提高正常小鼠血清睪丸酮水平［11］。本研究結(jié)果顯示，左歸丸治療組睪丸組織SCF及其mRNA表達(dá)水平明顯增高，與雷公藤多苷模型組比較有差異。

綜上所述，左歸丸可上調(diào)SCF及其mRNA表達(dá)水平，促進(jìn)精原干細(xì)胞的分裂和增殖，抑制生精細(xì)胞的凋亡。然而SCF只是眾多影響生精因素中的一員，左歸丸是否對(duì)其他凋亡因子亦或通路有影響，以及左歸丸改善大鼠生精功能的機(jī)制仍有待進(jìn)一步發(fā)掘與研究。

作者貢獻(xiàn)：王彬負(fù)責(zé)文章構(gòu)思、設(shè)計(jì)，文章的可行性分析，撰寫(xiě)論文；李霄負(fù)責(zé)論文數(shù)據(jù)整理、資料收集及部分論文撰寫(xiě)；馬凰富負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)實(shí)施、論文統(tǒng)計(jì)分析；祝雨田負(fù)責(zé)論文修訂；馬健雄、王繼升整理數(shù)據(jù)；黨進(jìn)負(fù)責(zé)論文、英文修訂；李海松負(fù)責(zé)文章質(zhì)量控制和審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。

本研究不足：

（1）本研究采用自身前后對(duì)照研究的方式進(jìn)行臨床觀察，未來(lái)的進(jìn)一步深入臨床研究要在此基礎(chǔ)上收集更大樣本量，設(shè)計(jì)更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)方案；（2）本研究?jī)H涉及干細(xì)胞因子（SCF）及其mRNA表達(dá)水平，將來(lái)要在此基礎(chǔ)上檢測(cè)其他調(diào)控生精細(xì)胞凋亡因子，深入探索其之間的相互聯(lián)系，為中醫(yī)治療男性不育癥的機(jī)制提供更為準(zhǔn)確的依據(jù)。