柴瑩，周影，陳曉敏，童茂清

（寧波市第一醫(yī)院，浙江 寧波 315010，1.中西醫(yī)結(jié)合科；2.分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室；3.心內(nèi)科）

心律失常是心血管系統(tǒng)常見病、多發(fā)病，心肌細(xì)胞的異常興奮（如離子通道功能異常等）和細(xì)胞間傳導(dǎo)異常（如縫隙連接蛋白異常等）是心律失常發(fā)生的主要原因。鑒于心律失常發(fā)病的顯著節(jié)律性，大量研究探索了生物鐘與心律失常的可能聯(lián)系。YAMASHITA等[1]的研究顯示，幾種心臟鉀離子通道基因的表達(dá)有顯著的節(jié)律性。本課題組前期研究提示，視上核可能通過自主神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)著心臟離子通道的節(jié)律性表達(dá)[2]。然而，心臟縫隙連接蛋白基因的表達(dá)是否同樣具有節(jié)律性，及其與生物鐘系統(tǒng)的相關(guān)性尚未見報道。為此，本研究觀察在小鼠心臟中縫隙連接蛋白基因的表達(dá)情況，以及生物鐘系統(tǒng)對縫隙連接蛋白基因的調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 6周齡C57BL/6小鼠[購自南京大學(xué)模式動物研究所，生產(chǎn)許可證號為SCXK（蘇）2010-0001]和Clock mutant小鼠（購自美國杰克遜實(shí)驗(yàn)室）各40只被單獨(dú)飼養(yǎng)在12 h光照/12 h黑暗環(huán)境下2周（8：00開燈，20：00關(guān)燈），可自由進(jìn)食飲水。本研究通過寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物福利委員會批準(zhǔn)。1.2 RNA回收及實(shí)時熒光定量PCR 在苯巴比妥鈉麻醉下，每6 h處死10只小鼠，快速回收心房、心室組織，保存于RNA保存液中（RNAlater，美國賽默飛世爾公司）。采用RNeasy1 Fibrous Tissue Mini kit（德國Qiagen公司）回收總RNA，反轉(zhuǎn)錄之前檢測RNA的濃度和純度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參，在StepOne-PlusTM（美國ABI公司）上檢測各基因mRNA水平。反應(yīng)條件為：94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。實(shí)驗(yàn)中使用的PCR引物見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 各基因的mRNA水平的24 h變化節(jié)律用least-squares cosine-curve fitting法分析。以下參數(shù)被用于分析晝夜節(jié)律的特點(diǎn)：①節(jié)律的顯著性；②周期性變化數(shù)值的算術(shù)平均值；③振幅和時相。各參數(shù)用 ±s表示，2組參數(shù)的比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Clock變異小鼠的生物鐘系統(tǒng)失去正常功能在野生型小鼠的心房和心室中，生物鐘基因Per2

和鐘控基因Dbp的mRNA水平顯示出顯著的晝夜節(jié)律性；在Clock變異小鼠中，兩基因表達(dá)均失去節(jié)律性，且各基因表達(dá)的均值和振幅均顯著低于野生型小鼠，表明該小鼠體內(nèi)的生物鐘系統(tǒng)失去正常功能。見圖1。

2.2 小鼠心臟中縫隙連接蛋白基因的表達(dá)呈顯著晝夜節(jié)律性 在野生型小鼠的心臟中，兩種縫隙連接蛋白基因Cx40和Cx43的mRNA水平具有顯著的晝夜節(jié)律性：在心房中，兩基因的表達(dá)峰值均出現(xiàn)在光照階段，而在心室中，僅Cx43的表達(dá)峰值出現(xiàn)在光照階段（見圖2）。在Clock變異小鼠中，心臟內(nèi)的兩種縫隙連接蛋白基因表達(dá)的節(jié)律性依然存在，但其節(jié)律的時相性發(fā)生顯著變化：在心房中，Cx40和

圖1 生物鐘基因在心房（A）和心室（B）中的表達(dá)情況（n=10）

圖2 縫隙連接蛋白基因在心房（A）和心室（B）中的表達(dá)情況（n=10）

Cx43的表達(dá)時相顯著后移；而在心室中，兩基因的表達(dá)時相顯著前移。Clock變異小鼠心室中兩基因表達(dá)的均值較野生型小鼠顯著增加，而兩基因表達(dá)的振幅及在心房內(nèi)表達(dá)的均值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2-3。

表2 各基因在野生型及Clock變異小鼠心房中的表達(dá)節(jié)律相關(guān)參數(shù)比較（n=10， ±s）

表3 各基因在野生型及Clock變異小鼠心室中的表達(dá)節(jié)律相關(guān)參數(shù)比較（n=10， ±s）

3 討論

心律失常的發(fā)生與異常心肌細(xì)胞電活動及（或）細(xì)胞間電傳導(dǎo)異常相關(guān)，這涉及一系列的心臟離子通道和縫隙連接蛋白基因。在過去40多年里，大量證據(jù)提示了縫隙連接和縫隙連接蛋白對正常心臟功能的重要性[3-4]。縫隙連接蛋白是構(gòu)成縫隙連接的基本單位，現(xiàn)在已知的縫隙連接蛋白有20多種，其中有4種在心臟中表達(dá)，包括Cx40、Cx43、Cx45和Cx30.2[5]。在心血管疾病中，其分布異?；虮磉_(dá)下調(diào)，從而導(dǎo)致心律失?；|(zhì)的產(chǎn)生。例如慢性壓力超負(fù)荷/左室收縮功能不全大鼠模型中，心肌細(xì)胞Cx43陽性縫隙連接的減少和（或）分布異常與房顫的高發(fā)密切相關(guān)[6]，心肌細(xì)胞縫隙連接重塑也與高甘油三酯血癥大鼠增加的室顫發(fā)生率相關(guān)[7]

心律失常的發(fā)病有顯著的晝夜節(jié)律性，研究表明這與離子通道基因表達(dá)及功能的節(jié)律性、心臟生理功能對自主神經(jīng)系統(tǒng)的反應(yīng)有關(guān)[8]。哺乳動物的生物鐘中樞位于下丘腦的視上核，此外在包括心臟的幾乎所有的外周臟器中均存在外周生物鐘系統(tǒng)。視上核通過自主神經(jīng)/神經(jīng)體液途徑發(fā)出的信號驅(qū)動并同步化各種行為和生理過程的節(jié)律。當(dāng)視上核被破壞后，這種節(jié)律性被打亂并引起一系列的下游效應(yīng)[9]。

本研究利用Clock變異小鼠觀察了Cx40和Cx43基因在心臟中的表達(dá)節(jié)律，Per2和Dbp基因被用作正常生物鐘系統(tǒng)功能的標(biāo)志，結(jié)果顯示在野生型小鼠中，Cx40和Cx43的表達(dá)呈顯著節(jié)律性，而在Clock變異小鼠中，這種節(jié)律性雖然保持，但其時相發(fā)生顯著變化，這意味著在正常的生物鐘功能缺失的情況下，縫隙連接蛋白基因的表達(dá)與外界環(huán)境失去同步性。

許多心血管參數(shù)如血壓、心率等均表現(xiàn)出明顯晝夜變化，這一現(xiàn)象之前主要被歸因于外界環(huán)境刺激的晝夜變化。隨著對生物鐘系統(tǒng)研究的不斷深入，生物鐘在心血管系統(tǒng)中的作用日益受到重視。生物鐘可能給心臟提供了一種手段，使得心血管系統(tǒng)可以“預(yù)測”外界環(huán)境的變化，從而可以提前做好準(zhǔn)備并做出最適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)，而生物鐘系統(tǒng)功能的異?？赡軙p害這一機(jī)制進(jìn)而導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生[10-11]。HAVAKUK等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，夜班輪班工人的心血管疾病發(fā)病率高于白班輪班工人，提示反復(fù)變化的作息時間可能導(dǎo)致生物鐘系統(tǒng)功能受損，進(jìn)而導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生。反之，心血管疾病也可能導(dǎo)致其本身的外周生物鐘系統(tǒng)的異常，進(jìn)而加重原有疾病。YOUNG等[13]報道，在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中，心臟的生物鐘系統(tǒng)功能受損。本研究顯示在機(jī)體生物鐘系統(tǒng)喪失正常功能時，Cx40和Cx43基因表達(dá)節(jié)律紊亂，這可能導(dǎo)致心臟電生理功能無法與機(jī)體的需求同步。

本研究結(jié)果提示了生物鐘系統(tǒng)可能參與了縫隙連接蛋白基因的節(jié)律性表達(dá)，而生物鐘功能異常會引起這一節(jié)律的紊亂，在未來研究中深入觀察在各種心血管疾病患者及動物模型中生物鐘與縫隙連接蛋白基因的相關(guān)性將有可能進(jìn)一步闡明這一調(diào)節(jié)的分子機(jī)制，并有可能發(fā)現(xiàn)新的心律失常的治療靶點(diǎn)，而對每個患者個體生物節(jié)律的評估則有可能為疾病的個體化治療提供更多依據(jù)。