吳趙龍 毛有東

2017年，瑞典皇家科學(xué)院將諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予3位生物物理學(xué)家，Jacques Dubochet，Joachim Frank和Richard Henderson，以表彰他們?cè)诎l(fā)展冷凍電子顯微鏡（cryoelectronmicroscopy，cryo-EM）方法學(xué)用于解析生物大分子高分辨結(jié)構(gòu)方面的杰出貢獻(xiàn)。冷凍電子顯微鏡技術(shù)經(jīng)過(guò)近50年的持續(xù)發(fā)展，通過(guò)實(shí)驗(yàn)與計(jì)算方法的結(jié)合，在無(wú)需生物大分子結(jié)晶或標(biāo)記的天然生理狀態(tài)下，可以解析出生物大分子的原子分辨率三維結(jié)構(gòu)，因而超越X射線晶體學(xué)和核磁共振技術(shù)，成為生物大分子精細(xì)結(jié)構(gòu)解析中應(yīng)用最為廣泛的關(guān)鍵技術(shù)之一。

1 電子顯微鏡技術(shù)解析生物樣品所面臨的挑戰(zhàn)

早在Ernst Ruska（1986年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)得主）發(fā)明電子顯微鏡后不久，Marton便提出，由于電子束對(duì)生物細(xì)胞與細(xì)胞器的轟擊，利用這一新設(shè)備對(duì)生物樣品進(jìn)行研究時(shí)，必然會(huì)對(duì)樣品造成損傷。與此同時(shí)，為避免空氣分子對(duì)電子束的散射，電子顯微鏡工作時(shí)需抽成高真空，導(dǎo)致腔內(nèi)樣品中的水分難以保持，丟失大量結(jié)構(gòu)信息。因此，如何減小電子束對(duì)生物大分子樣品的輻射損傷以獲得其盡可能高分辨的結(jié)構(gòu)信息，成為了電子顯微鏡技術(shù)解析生物大分子結(jié)構(gòu)的一大難題。Marton提出構(gòu)想，利用冷凍或類似負(fù)染的樣品制備方法，提高樣品的抗電子輻射損傷的能力。

然而，利用冷凍電子顯微鏡研究生物大分子結(jié)構(gòu)時(shí)，生物樣品的制備和拍攝過(guò)程仍面臨許多困難。與X射線晶體衍射法相比，單顆粒冷凍電子顯微鏡技術(shù)最為顯著的優(yōu)勢(shì)在于不需要生物樣品結(jié)晶。但同時(shí)也對(duì)樣品的制備提出了其他要求，為得到不重疊的單顆粒圖像，生物樣品必須非常薄，理想情況下只有一個(gè)生物大分子層的厚度。在拍攝電鏡圖像的過(guò)程中，由于電子束的作用和熱運(yùn)動(dòng)的影響，生物大分子通常會(huì)發(fā)生漂移，尤其是使用攝像模式不做修正地記錄圖像時(shí)，將導(dǎo)致圖像模糊，高分辨結(jié)構(gòu)信息丟失。此外，冷凍樣品中生物分子與水分子的化學(xué)組成元素相似，且成像時(shí)必須使用低電子劑量以減小電子輻射損傷，故圖像襯度和信噪比通常很低。獲得大量生物大分子的二維投影圖像后，根據(jù)構(gòu)象和歐拉角取向進(jìn)行準(zhǔn)確分類是單顆粒冷凍電子顯微鏡技術(shù)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)重建的核心問(wèn)題。但是，原始單顆粒圖像的低信噪比對(duì)分類算法提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

2 冷凍電子顯微鏡樣品制備方法的突破

電子顯微鏡的生物樣品制備方法先后經(jīng)歷了負(fù)染到冷凍的發(fā)展過(guò)程。20世紀(jì)40年代，負(fù)染技術(shù)問(wèn)世，并在其后的20年內(nèi)得到不斷地應(yīng)用和完善。負(fù)染操作是將生物材料嵌入重金屬鹽的非晶薄膜，在其周圍形成一層能夠抵御電子損傷的輪廓，且水分流失時(shí)不發(fā)生變化，所以能夠保持生物細(xì)胞或細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)信息。然而，通過(guò)負(fù)染制樣方法解析的生物大分子結(jié)構(gòu)分辨率低，因而應(yīng)用范圍受到限制，現(xiàn)在一般用來(lái)檢查樣品或建立初始模型，而高分辨結(jié)構(gòu)的解析有必要尋求更有效的制樣方法。

20世紀(jì)70年代中葉，Henderson和Unwin在制樣技術(shù)上邁出了新的一步。Henderson和合作者不對(duì)生物樣品染色，而是使用葡萄糖溶液代替水來(lái)保存樣品，并使用約1e－/?2的低劑量電子束將樣品的損傷降到最小，實(shí)現(xiàn)了室溫下對(duì)天然蛋白晶體的解析。通過(guò)這種制樣方法，Henderson和合作者得到了過(guò)氧化氫酶晶體和紫膜中細(xì)胞視紫紅質(zhì)二維晶體的投影圖像，并且旋轉(zhuǎn)樣品以獲取不同方向的投影圖像，建立了細(xì)胞視紫紅質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)密度圖，揭示了蛋白質(zhì)的一般結(jié)構(gòu)特征，但是這種方法只能解析到較低的分辨率。直到冷凍樣品制備技術(shù)成熟以后，Henderson等人繼續(xù)發(fā)展冷凍條件下的二維晶體電子成像和電子衍射方法，終于在1990年得到了近原子分辨的細(xì)胞視紫紅質(zhì)三維冷凍電子顯微鏡結(jié)構(gòu)。

1981年，Dubochet和McDowall系統(tǒng)地提出了非晶態(tài)冰冷凍的制樣方法。冷凍的制樣流程，首先將生物大分子的水溶液均勻地噴涂在銅網(wǎng)表面的碳膜上，而后迅速浸入約－170℃的液態(tài)乙烷（液氮降溫）中，生物大分子周圍形成一層非常薄的非晶態(tài)冰，可以提高樣品的抗電子能力，并保持水分不流失。Dubochet等人的研究還發(fā)現(xiàn)，非晶態(tài)冰在溫度低于－160℃的環(huán)境中不會(huì)發(fā)生結(jié)晶，為單顆粒冷凍樣品的穩(wěn)定保存奠定了基礎(chǔ)。

Dubochet和合作者提出的單顆粒冷凍制樣技術(shù)適用范圍十分廣泛，并且能夠在拍攝電子顯微鏡時(shí)保持生物中含量最多、占比最大的水分不流失，解決了自電子顯微鏡發(fā)明以來(lái)近50年未能克服的技術(shù)難題，因而從20世紀(jì)80年代該方法問(wèn)世開(kāi)始就迅速發(fā)展，現(xiàn)已成為冷凍電子顯微鏡單顆粒重構(gòu)與電子斷層成像技術(shù)中不可或缺的標(biāo)準(zhǔn)制樣方法。

3 冷凍電子顯微鏡單顆粒分析技術(shù)的開(kāi)創(chuàng)

冷凍電子顯微鏡單顆粒重構(gòu)技術(shù)的數(shù)據(jù)處理包括：?jiǎn)晤w粒圖像抽取、圖像分類、三維重建和高分辨密度圖精化。在數(shù)據(jù)處理算法的發(fā)展過(guò)程中，F(xiàn)rank和合作者做出了開(kāi)創(chuàng)性的貢獻(xiàn)。20世紀(jì)70年代中期，F(xiàn)rank和合作者提出了基于互相關(guān)系數(shù)（cross-correlation）的電子顯微鏡單顆粒圖像分類算法。該算法的原理是計(jì)算單顆粒圖像之間的互相關(guān)系數(shù)，將相關(guān)性最高的歐拉角取向作為實(shí)際投影取向進(jìn)行分類平均。通過(guò)該算法的分析可以提高單顆粒圖像的信噪比，識(shí)別圖像的取向信息，并與Aaron Klug（1982年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主）提出的三維重建方法相結(jié)合，使生物大分子高分辨結(jié)構(gòu)的重建成為可能。然而，生物樣品通常具有異質(zhì)性，導(dǎo)致單顆粒投影并不來(lái)自于同一個(gè)三維構(gòu)象。1981年，F(xiàn)rank和van Heel提出了單顆粒圖像的聚類方法。這種基于K-means的分類算法將每張具有n×n個(gè)像素的圖像看作是n2維的數(shù)據(jù)，對(duì)應(yīng)于n2維超平面中的一個(gè)點(diǎn)，計(jì)算這些點(diǎn)之間的距離使最臨近的點(diǎn)聚為一類，最后對(duì)每一類中的圖像做平均得到低噪聲的單顆粒圖像。此后，F(xiàn)rank和Michael Radermacher在1986—1987年提出圓錐任意傾角方法（random conical tilt），van Heel在1987年提出公共線方法（common line），用于解析生物大分子的三維電子顯微鏡初始模型。Frank和他的同事們發(fā)展了單顆粒冷凍電子顯微鏡技術(shù)中重要的數(shù)學(xué)工具，奠定了生物樣品高分辨重建的基礎(chǔ)。值得一提的是，F(xiàn)rank和合作者在20世紀(jì)70年代就將這套數(shù)據(jù)處理算法實(shí)現(xiàn)為SPIDER軟件包，供其他研究者使用。

1998年，Sigworth提出了基于最大似然（Maximum Likelihood）的圖像排列算法。Scheres等人在Frank等人建立起來(lái)的冷凍電子顯微鏡圖像數(shù)據(jù)分析框架下，將最大似然算法拓展到單顆粒圖像的分類，并用于改進(jìn)電子顯微鏡三維密度圖的高分辨精化算法。在最大似然方法實(shí)現(xiàn)過(guò)程中，每一張圖像并不具有確定的取向，而是給出其在各個(gè)取向上的概率作為似然函數(shù)，通過(guò)優(yōu)化似然函數(shù)進(jìn)行圖像分類。該算法有效降低了電子顯微鏡圖像背景噪聲的影響，提高了分類準(zhǔn)確度，由Scheres開(kāi)發(fā)成RELION程序，并迅速得到了廣泛的應(yīng)用。

4 冷凍電子顯微鏡技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀

自從20世紀(jì)90年代Henderson解析了細(xì)胞視紫紅質(zhì)的近原子分辨結(jié)構(gòu)、對(duì)單顆粒高分辨重建做了理論分析并指出需要克服的技術(shù)瓶頸以來(lái)，越來(lái)越多的生物大分子通過(guò)冷凍電子顯微鏡技術(shù)得到高分辨解析。2013年以來(lái)，由于直接電子探測(cè)器（direct electron detector）的應(yīng)用，冷凍電子顯微鏡三維重建的分辨率水平取得了重大突破。這種新型的電子探測(cè)裝置不僅可以記錄單電子（counting mode），得到很高的量子探測(cè)效率（detective quantum efficiency，DQE），而且響應(yīng)速度很快，可以在攝像模式（movie mode）下實(shí)時(shí)記錄生物樣品的變化，并由此對(duì)生物大分子的漂移做出修正。直接電子探測(cè)器和并行計(jì)算機(jī)等新技術(shù)在冷凍電子顯微鏡成像分析中的運(yùn)用，將單顆粒三維重建的分辨率提升到前所未有的精度，因而使單顆粒冷凍電子顯微鏡技術(shù)在生物大分子的結(jié)構(gòu)解析方面得到了非常廣泛的應(yīng)用。在小蛋白、超大復(fù)合體和膜蛋白方面，單顆粒冷凍電子顯微鏡都可以達(dá)到近原子分辨，典型的比如二十面體病毒顆粒，瞬態(tài)感受器電位陽(yáng)離子通道子類V成員1（TRPV1）和G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）。少數(shù)情況下，該技術(shù)幾乎達(dá)到原子分辨，可與X-ray晶體衍射媲美，如1.8 ?的谷氨酸脫氫酶（GDH）。采用相位板的冷凍電子顯微鏡技術(shù)甚至將65 kD的血紅蛋白解析到了3.2 ?。與此同時(shí)，F(xiàn)rank及其合作者還將冷凍電子顯微鏡與機(jī)器學(xué)習(xí)相結(jié)合，用于還原生物大分子機(jī)器的低分辨能量景觀，為冷凍電子顯微鏡的未來(lái)應(yīng)用拓展提供了新的可能。

我國(guó)冷凍電子顯微鏡發(fā)展起步相對(duì)歐美較晚。其應(yīng)用自2015年以來(lái)卻趕上了由直接電子探測(cè)器推動(dòng)的單顆粒冷凍電子顯微鏡的應(yīng)用熱潮，并取得了令人矚目的成果。應(yīng)用高分辨冷凍電子顯微鏡的代表性工作有剪切體、炎癥體、蛋白酶體和藻膽體等等。本課題組在國(guó)內(nèi)率先開(kāi)展冷凍電子顯微鏡和人工智能的交叉領(lǐng)域的研究，將統(tǒng)計(jì)流形學(xué)習(xí)、聚類學(xué)習(xí)、深度學(xué)習(xí)等技術(shù)用于提升冷凍電子顯微鏡數(shù)據(jù)處理的算法性能、精度和效率，并開(kāi)發(fā)成ROME軟件包，初步應(yīng)用于蛋白酶體全酶的動(dòng)力學(xué)研究，為冷凍電子顯微鏡在未來(lái)實(shí)現(xiàn)生物大分子高分辨動(dòng)力學(xué)分析打下了基礎(chǔ)。

5 總結(jié)與展望

Dubochet發(fā)展了用于冷凍電子顯微鏡樣品制備的一般方法，奠定了單顆粒冷凍電子顯微鏡的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；Frank提出了單顆粒重建和高分辨密度圖精化的一整套計(jì)算方法和技術(shù)框架，并通過(guò)軟件將之實(shí)現(xiàn)，奠定了單顆粒冷凍電子顯微鏡實(shí)現(xiàn)精細(xì)結(jié)構(gòu)解析的理論算法基礎(chǔ)；Henderson通過(guò)發(fā)展電子晶體學(xué)方法和對(duì)單顆粒三維重構(gòu)的理論分析，證明了冷凍電子顯微鏡技術(shù)解析生物大分子精細(xì)結(jié)構(gòu)的可行性，為冷凍電子顯微鏡技術(shù)發(fā)展指出了一條明路。Dubochet，F(xiàn)rank和Henderson的獲獎(jiǎng)不僅僅是對(duì)他們?cè)诶鋬鲭娮语@微鏡方法學(xué)的開(kāi)創(chuàng)性研究工作的表彰，更是對(duì)冷凍電子顯微鏡技術(shù)繼續(xù)蓬勃發(fā)展和在交叉學(xué)科中應(yīng)用的激勵(lì)。

在冷凍電子顯微鏡能夠?qū)⑸锎蠓肿拥撵o態(tài)結(jié)構(gòu)解析到原子分辨率的基礎(chǔ)上，物理學(xué)家們對(duì)生物大分子系統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)復(fù)雜性與熱力學(xué)統(tǒng)計(jì)性質(zhì)表現(xiàn)出極大的興趣。生命體內(nèi)的生物大分子并不是穩(wěn)定不變的，由于生物系統(tǒng)動(dòng)力學(xué)或熱力學(xué)物理量的變化，生物大分子會(huì)表現(xiàn)出亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象甚至連續(xù)構(gòu)象變化的非平衡態(tài)。與此同時(shí)，冷凍電子顯微鏡已經(jīng)初步具備了對(duì)生物大分子系綜中的每一個(gè)子系統(tǒng)進(jìn)行非平衡態(tài)解析的能力，因而將可能發(fā)展成為研究生物大分子能量景觀與非平衡統(tǒng)計(jì)性質(zhì)的最有力工具。生物大分子系綜的非平衡統(tǒng)計(jì)規(guī)律與其原位功能信息之間的關(guān)系，也將成為冷凍電子顯微鏡技術(shù)的下一階段的研究重點(diǎn)之一。這類研究最終將幫助我們認(rèn)識(shí)生命的能量本質(zhì)，揭示生物復(fù)雜性背后的基本規(guī)律。此外，冷凍電子顯微鏡還將在藥物設(shè)計(jì)、精準(zhǔn)分子醫(yī)療和軟物質(zhì)材料等影響人類生活質(zhì)量的重大應(yīng)用研究領(lǐng)域中發(fā)揮核心驅(qū)動(dòng)作用。?