克隆猴為什么會誕生在中國？

陳冰

2012年，體細(xì)胞重編程技術(shù)獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。就在那一年，蒲慕明和同事們在浙江烏鎮(zhèn)舉行的非人靈長類研究小型專題研討會上提出：再難也要把體細(xì)胞克隆猴做出來！

2017年11月27日，世界上首只體細(xì)胞克隆猴“中中”在中國誕生，緊接著，10天之后，第二只克隆猴“華華”又順利誕生。1月25日，由位于上海的中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所蒲慕明、孫強領(lǐng)導(dǎo)的研究團隊在國際權(quán)威學(xué)術(shù)期刊《細(xì)胞》上發(fā)表論文，宣布了這一令世界震驚的成果。

從1996年第一只克隆羊“多莉”誕生以來，21年間，各國科學(xué)家利用體細(xì)胞先后克隆了牛、鼠、貓、狗等動物，但一直沒有跨越與人類最相近的非人靈長類動物的“屏障”。

“全世界的神經(jīng)科學(xué)家和藥企都在期盼它們的出現(xiàn)?！敝袊茖W(xué)院院士、神經(jīng)所所長蒲慕明說，腦科學(xué)發(fā)展到今天，小鼠的大腦與人腦的區(qū)別太大，已無法勝任很多實驗任務(wù)，無論是新藥研發(fā)還是科學(xué)研究，都需要發(fā)展出更接近人類的非人靈長類模式動物。

體細(xì)胞克隆猴的成功，標(biāo)志著最接近人類的靈長類動物——猴子將成為了人類疾病的動物模型，它將為腦疾病、免疫缺陷、腫瘤、代謝等疾病的機理研究、干預(yù)、診治帶來前所未有的光明前景?！斑@是世界生命科學(xué)領(lǐng)域近年來的重大突破?！逼涯矫髟菏空f。

克隆猴為什么難？它的誕生有什么價值？它為什么又會誕生在中國呢？

中國式攻關(guān)

截至目前，同為雌性的克隆猴“中中”和“華華”已經(jīng)在恒溫箱里茁壯成長了兩個月，在科研人員24小時的精心呵護下，它們的各項身體指標(biāo)均很正常，發(fā)育狀態(tài)良好。除了體形大小略有差異，姐妹倆看不出什么區(qū)別。喝奶粉、玩娃娃、互相打鬧，它們的萌表情吸引了全世界的目光。

其實，“中中”和“華華”并不是世界上誕生的第一只克隆猴。早在2000年，美國俄勒岡靈長類動物研究中心就通過胚胎分裂法克隆了獼猴Tetra。這種克隆方法不同于科學(xué)家們常用的體細(xì)胞核移植技術(shù)，而是把多個猴胚胎（107個）進行分裂，然后對胚胎進行移植，結(jié)果有4個能夠發(fā)育，最終只有Tetra在胚胎分裂157天之后幸運地降生。不過這種克隆方法并沒有得到學(xué)術(shù)界較大關(guān)注，因為它與一般意義上的體細(xì)胞克隆技術(shù)有較大差別，技術(shù)難度也不在一個層次上。

體細(xì)胞是一個相對于生殖細(xì)胞的概念。它是一類細(xì)胞，其遺傳信息不會像生殖細(xì)胞那樣遺傳給下一代。

“體細(xì)胞是執(zhí)行特殊功能的，比如紅細(xì)胞是執(zhí)行運氧功能的，免疫細(xì)胞是執(zhí)行免疫防御功能的，它們不具有發(fā)育的特性。但有部分體細(xì)胞可以在體外進行培養(yǎng)實現(xiàn)無限增殖，可以拿到無數(shù)的體細(xì)胞。”中科院神經(jīng)科學(xué)研究所非人靈長類研究平臺主任孫強說。

利用這個特點，體細(xì)胞克隆技術(shù)應(yīng)運而生。體細(xì)胞克隆技術(shù)又可稱體細(xì)胞核移植技術(shù)。首先，需要把動物體細(xì)胞分離培養(yǎng)，然后再采用核移植的方法，將卵母細(xì)胞去核作為核受體，以體細(xì)胞或含少量細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞核即核質(zhì)體作為核供體，將后者移入前者中，構(gòu)建重組胚，供體核在去核卵母細(xì)胞的胞質(zhì)中重新編程，并啟動卵裂，開始胚胎發(fā)育過程，妊娠產(chǎn)仔。

此次“中中“和“華華”的基因，都來自同一個流產(chǎn)的雌性獼猴胎兒?？蒲腥藛T提取了這個獼猴胎兒的體細(xì)胞（非生殖細(xì)胞），通過技術(shù)手段將其細(xì)胞核“植入”若干個“摘除”了細(xì)胞核的卵母細(xì)胞。然后再通過代孕猴子孕育出“中中“和“華華”這兩只食蟹猴。

以往用普通的猴子做實驗動物模型，存在兩個劣勢。

“一是猴子的繁殖力低，傳代時間長。一個猴子的懷孕周期是160天，從一個小猴子出生到性成熟可以懷孕生育至少要等4年到6年時間。而建立一個基因體系的模式動物需要繁殖近20代，相當(dāng)于要花費百年時間，誰也等不起。改用體細(xì)胞來繁殖，猴子的繁殖周期可以縮短到8至10個月。二是遺傳背景復(fù)雜。因為猴子的父親母親都不一樣，其基因來源不一樣，遺傳背景就不一樣，這樣個體差異大，對實驗干擾就會比較大?！睂O強說。

基于此，一直以來世界各國的科研人員都在想辦法攻克這個難題。世界上很多優(yōu)秀的生命科學(xué)實驗室都嘗試過，很多連囊胚都很難獲得。2003年，權(quán)威學(xué)術(shù)期刊《科學(xué)》發(fā)表了一篇美國匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究人員的論文，論文稱，用現(xiàn)有技術(shù)克隆靈長類動物“是行不通的”。

最接近成功的一次實驗發(fā)生在2010年。美國俄勒岡靈長類研究中心的著名科學(xué)家米塔利波夫率領(lǐng)團隊成功移植了克隆猴胚胎，但胚胎發(fā)育至81天，以流產(chǎn)告終。

2012年，體細(xì)胞重編程技術(shù)獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。就在那一年，蒲慕明和同事們在浙江烏鎮(zhèn)舉行的非人靈長類研究小型專題研討會上提出：再難也要把體細(xì)胞克隆猴做出來！

當(dāng)蒲慕明將攻克體細(xì)胞克隆猴的任務(wù)交給孫強時，孫強認(rèn)為成功的希望并不大，但他還是接下這個“不可能的任務(wù)”，開始了艱難探索。讓人驚嘆的是，這對取得重大科學(xué)突破的師生——孫強和劉真，都是從未喝過“洋墨水”的本土人才。

當(dāng)時，劉真還只是一名二年級的碩士研究生。2016年，劉真博士畢業(yè)時，已經(jīng)因自閉癥猴子的研究，在英國《自然》雜志上發(fā)表過一篇論文。原本，以這樣的條件，申請世界上任何一個一流實驗室的博士后，他都可以順利成行。而劉真卻決定留在神經(jīng)所位于蘇州西山的非人靈長類研究平臺，與導(dǎo)師孫強一起挑戰(zhàn)這個世界級難題。

蒲慕明說，劉真做了一個正確的選擇。因為他去再好的實驗室，它們都不會把一個風(fēng)險如此巨大的課題，交給一個初來乍到的博士后去做。不過，為了讓劉真能夠安心留下，神經(jīng)所特事特辦，給了他超出一般博士后的優(yōu)厚待遇。蒲慕明認(rèn)為，體細(xì)胞克隆猴5年攻關(guān)成功的關(guān)鍵，就在于孫強領(lǐng)導(dǎo)了一支精誠合作、刻苦耐勞、堅持不懈的團隊。endprint

為此，蒲慕明特別呼吁國家在“青年千人”計劃之外，制定相應(yīng)的人才政策吸引本土優(yōu)秀青年留在國內(nèi)做研究。他說，現(xiàn)在優(yōu)秀的博士生總希望能夠去國外優(yōu)秀實驗室，然后作為“青年千人”被引進回國，這樣就能獲得更好的學(xué)術(shù)地位和待遇，而這等于讓優(yōu)秀青年科研人才將生命中最旺盛的創(chuàng)新精力發(fā)揮在了祖國之外。

“為什么我們不能讓他們留在國內(nèi)呢？我敢說，如果沒有中國留學(xué)生，美國很多實驗室的創(chuàng)新活力都將打折?！逼涯矫髡f，中國的科研條件已經(jīng)不比國外差，是時候調(diào)整人才政策，吸引更多優(yōu)秀的青年科學(xué)家留在國內(nèi)做博士后，把他們的“最強創(chuàng)造力”用在中國創(chuàng)新上。

梳理孫強團隊在《細(xì)胞》雜志上的論文細(xì)節(jié)，我們可以看到團隊其實是嘗試了兩種體細(xì)胞。一種是猴胎兒成纖維細(xì)胞，另一種是猴卵丘細(xì)胞（位于卵丘的卵泡細(xì)胞）。利用猴胎兒成纖維細(xì)胞的一組中，研究人員將獲得的79個克隆胚胎（處于2細(xì)胞至囊胚期）移植入21只代孕母猴中，最終有6只代孕母猴成功懷孕，共攜帶5個胎兒（有一個懷孕的是雙胞胎），另外兩只僅攜帶了孕囊（gestational sacs）。4只代孕成功的母猴有兩只流產(chǎn)，剩下兩只正常懷孕超過140天，然后通過剖腹產(chǎn)手段獲得兩只存活的幸運克隆猴“中中”和“華華”。

而利用猴卵丘細(xì)胞的一組中，最終有兩只胎兒發(fā)育超過了130天，通過剖腹產(chǎn)手術(shù)出生后不久就死亡了（分別在出生3小時和30小時后死亡）。

可以說，“中中”和“華華”的順利誕生、健康成長離不開科研人員、獸醫(yī)、護理員無微不至的照料?！皥F隊成員照顧一只猴子，真的就跟照顧一個孩子似的?！?/p>

給猴子接生，相當(dāng)于給人類嬰兒接生，工作量一點也不小。為了不讓任何一只如國寶般珍貴的體細(xì)胞克隆猴幼崽臨產(chǎn)夭折，科研人員們更是24小時不間斷地輪流觀察，并發(fā)明了獨特的微信“打卡”法，每半小時向主管報告一次，以保證觀測員的清醒狀態(tài)。一位科研人員發(fā)朋友圈說，晚上睡覺最怕聽到電話鈴響，“這意味著猴子們又出狀況了?！睂O強說，那里條件十分艱苦，十幾個人輪流買菜做飯，忙起來連春節(jié)也不能回家。

正是科研團隊通過5年的不斷攻關(guān)，嘔心瀝血，在經(jīng)歷了無數(shù)次失敗和許多方法的改進之后，才最終獲得成功。

克隆猴子到底有多難？

早在1999年，時任中國科學(xué)院院長路甬祥即邀請國際神經(jīng)科學(xué)界的著名科學(xué)家蒲慕明回國，組建與國際接軌的全新科研機構(gòu)——中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所。蒲慕明說，神經(jīng)所近年來在世界上的確已經(jīng)相當(dāng)有名，但要成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的領(lǐng)跑者，必須要有不斷產(chǎn)生重大突破的持續(xù)創(chuàng)新力。

何為重大突破？開創(chuàng)新的研究領(lǐng)域，或者在現(xiàn)有領(lǐng)域中取得里程碑式的成果——世界頂尖的科研機構(gòu)都是如此。每個科研領(lǐng)域都有眾所周知的重大未解難題，能在一個領(lǐng)域不斷產(chǎn)生重大突破，才是該領(lǐng)域的領(lǐng)跑者。在蒲慕明看來，孫強團隊的體細(xì)胞克隆猴成果就是生命科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的一次重大突破。它標(biāo)志著一個嶄新時代的誕生：幾年后，一大群具有相同遺傳背景的實驗猴，將成為生命科學(xué)實驗和新藥研發(fā)的人類新替身。

孫強團隊經(jīng)過5年的研究分析認(rèn)為，體細(xì)胞克隆的關(guān)鍵節(jié)點主要分為四個階段：胚胎構(gòu)建、激活、核基因啟動，以及著床后發(fā)育。其中，前三個階段，也就是胚胎細(xì)胞從一個細(xì)胞依次分裂成2、4、8個細(xì)胞的過程是最關(guān)鍵的。

孫強介紹，克隆猴主要有三個難點。難點之一是細(xì)胞核不易識別，“去核”難度大。作為受體的卵母細(xì)胞，必須先把細(xì)胞核“摘除”，才能容納體細(xì)胞的細(xì)胞核這個“外來戶”。但是，猴的卵母細(xì)胞核去核難度非常大。

孫強團隊中，博士后劉真是“去核”的主要操作者。為了能在去核過程中以最短時間內(nèi)、用最小損耗完成“去核”工作，減少對卵母細(xì)胞的損害，劉真苦練一年半技術(shù)，經(jīng)過“千錘百煉”，如今的他可以在閃爍的偏振光源下，只用52秒就能以極小的損傷為6個卵母細(xì)胞去核，還能在15秒內(nèi)將體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到卵母細(xì)胞內(nèi)——這項技術(shù)上，他絕對算得上世界冠軍。

難點之二，是卵細(xì)胞容易提前激活。克隆過程中，體細(xì)胞的細(xì)胞核進入卵細(xì)胞時，需先“喚醒”卵細(xì)胞，然后才啟動一系列發(fā)育“程序”。因此，“喚醒”的時機要求非常精準(zhǔn)。但是，使用傳統(tǒng)方式，猴的卵細(xì)胞很容易被提前“喚醒”，往往導(dǎo)致克隆“程序”無法正常啟動。只要操作上稍一不小心，卵母細(xì)胞就可能被激活，然后它就會先開始自主卵裂，體細(xì)胞就跟不上了，最后導(dǎo)致這個卵無法發(fā)育。

難點之三，是體細(xì)胞克隆胚胎的發(fā)育效率低。被轉(zhuǎn)移到卵細(xì)胞里的細(xì)胞核，突然要扮演受精卵的角色，“趕鴨子上架”很不適應(yīng)，需要科學(xué)家采取多種手段“保駕護航”。如果“保駕”不力，絕大多數(shù)克隆胚胎都難以正常發(fā)育，往往胎死腹中。

為此，團隊成員除了進行猴體細(xì)胞核移植技術(shù)的訓(xùn)練之外，還通過不斷嘗試優(yōu)化體細(xì)胞克隆胚胎的激活和培養(yǎng)體系?！巴械难芯拷沂玖伺咛ピ缙诮M蛋白修飾對胚胎發(fā)育至關(guān)重要，去乙?；敢种苿㏕SA和組蛋白去甲基化酶KDM家族能有效提高克隆胚胎的囊胚發(fā)育率?！睂O強說，“我們在食蟹猴體細(xì)胞核移植體系中找到了TSA和Kdm4d的理想濃度組合，囊胚率一下子提高到46%，優(yōu)質(zhì)率也從7%提升到30%。并且利用卵丘顆粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為供體做了大量的實驗，終于實現(xiàn)了一個最重要物種的克隆?！?/p>

通過DNA指紋鑒定，“中中”和“華華”的核基因組信息與體細(xì)胞供體完全一致，證明姐妹倆都是正宗的克隆猴。

孫強表示，此次6只猴子代孕，生出2個克隆猴子，基本上達(dá)到了自然繁殖率的一半水平。未來要在目前取得成功的基礎(chǔ)上，著力提高效率，以滿足實際應(yīng)用需求。

克隆猴已經(jīng)誕生，那么是否意味著克隆人離我們已經(jīng)不遠(yuǎn)了呢？蒲慕明與孫強很堅定地說了“不”。蒲慕明介紹，體細(xì)胞克隆猴技術(shù)的突破，表明理論上克隆人的技術(shù)障礙基本去除，但是做克隆猴的目的完全是為了建立動物模型來幫助治療人類的各種疾病，不僅沒有必要進行克隆人的研究，而社會的倫理道德也不允許克隆人。

模型動物的巨大價值

“克隆猴的誕生意味著中國將率先建立起可有效模擬人類疾病的動物模型?！睂O強說，這既能滿足腦疾病和腦高級認(rèn)知功能研究的迫切需要，又可廣泛應(yīng)用于新藥測試。

孫強介紹，如果實驗對象的遺傳背景不同，“實驗組”和“對照組”的說服力就不夠強。傳統(tǒng)醫(yī)藥實驗大量采用小鼠，很大程度上是因為鼠類可通過快速近親繁殖，培育出大量非常相似的小鼠。

但由于小鼠和人類相差太遠(yuǎn)，針對小鼠研發(fā)的藥物在人體檢測時大都無效或有副作用。據(jù)了解，這是目前絕大多數(shù)腦疾病研究無法取得突破的一個主要原因。

談到體細(xì)胞克隆猴構(gòu)建成功的意義，蒲慕明表示，首先證實了獼猴可以用體細(xì)胞來克隆，二是獼猴可以成為真正有用的動物模型。

“克隆猴遺傳背景相同，可以減少個體間差異對實驗的干擾，大大減少了實驗動物使用數(shù)量。同時，通過體細(xì)胞克隆技術(shù)，模型猴制備時間縮短到一年內(nèi)，復(fù)雜和精準(zhǔn)的基因編輯可以在體外培養(yǎng)的細(xì)胞進行?！逼涯矫髡f。

此外，體細(xì)胞克隆猴的成功，將推動我國率先發(fā)展出基于非人靈長類疾病動物模型的全新醫(yī)藥研發(fā)產(chǎn)業(yè)鏈，促進針對阿爾茨海默病、自閉癥等腦疾病，以及免疫缺陷、腫瘤、代謝性疾病的新藥研發(fā)進程。

美國的杰克森實驗室建立于1929年，是世界上最大的模式動物研發(fā)基地和銷售公司，為國際生物醫(yī)學(xué)界培養(yǎng)并出售7000多種基因編輯小鼠品系?！暗冗@項技術(shù)成熟后，未來，我國也可建成以非人靈長類為模型的主要研發(fā)基地和產(chǎn)業(yè)鏈?！逼涯矫髡f：“以我國科學(xué)家為主導(dǎo)的靈長類全腦圖譜計劃的實施和靈長類腦科學(xué)的前沿研究，將進一步使我國成為世界腦科學(xué)人才的匯聚高地?！眅ndprint