外泌體在疾病實驗診斷和臨床治療中的研究進(jìn)展*

蒲雙雙，李金星 (山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，濟(jì)南250011)

外泌體是直徑介于40～100 nm之間的囊泡樣結(jié)構(gòu)，外層由雙層磷脂膜包裹，內(nèi)含有豐富的micro RNA及蛋白質(zhì)等成分。外泌體分布廣泛，存在于血液、尿液、唾液、腦脊液，以及胸腹腔積液等幾乎所有體液中，無創(chuàng)易獲取。

外泌體的形成不同于普通微泡的出芽脫落，而是選擇性地富集其來源細(xì)胞中的一些分子形成多胞體，然后在RAB酶等的作用下與細(xì)胞膜融合釋放。被選擇的分子可以顯示外泌體來源，也可以反映來源細(xì)胞的生理病理狀態(tài)，提示外泌體有應(yīng)用于疾病診斷的潛質(zhì)。更重要的是，外泌體中miRNA和蛋白質(zhì)豐度遠(yuǎn)高于血清，提示外泌體組分作為診斷標(biāo)志物將更為敏感。基因檢測技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，也使檢測外泌體組分用于疾病診斷成為可能。

外泌體參與物質(zhì)運輸，通過各種機(jī)制在生物信息傳遞中發(fā)揮重要作用。外泌體作為天然的細(xì)胞生物信息傳遞工具，因其低免疫原性、能越過生物屏障、能歸巢靶組織、能有效入侵受體細(xì)胞等特性，被認(rèn)為是基因和藥物靶向治療的最佳運輸載體。另外，基于外泌體在疾病發(fā)生發(fā)展中起重要作用，抑制外泌體的分泌以及干擾其特定分子的表達(dá)以增強(qiáng)機(jī)體免疫力也是疾病治療的新方法。外泌體還有被開發(fā)成腫瘤疫苗的潛質(zhì)。

本文就近五年來血液和尿液來源的外泌體中miRNA和蛋白質(zhì)組分在人體各個系統(tǒng)疾病實驗診斷方面的相關(guān)研究以及外泌體在疾病臨床治療尤其是腫瘤治療中的研究進(jìn)展作如下綜述。

1 外泌體用于各系統(tǒng)疾病實驗診斷的相關(guān)研究進(jìn)展

1.1 消化系統(tǒng)

1.1.1 胰腺癌:Melo等［1］認(rèn)為磷脂酰肌醇聚糖1(glypican-1，GPC1)可以作為胰腺癌的早期診斷指標(biāo)，因為從早期胰腺癌患者血清中可以檢測到GPC1+循環(huán)外泌體，而在健康對照組及胰腺良性病變患者的血清中未檢測到GPC1+循環(huán)外泌體。另外，對GPC1+外泌體進(jìn)行定量，可間接反映胰腺癌瘤體的大小，且可早于核磁共振發(fā)現(xiàn)胰腺上皮細(xì)胞的病變。Madhavan等［2］發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者外泌體中4種蛋白(CD44v6，Tspan8，Ep CAM 和 CD104)及 4種 miRNA(miR-1246，miR-4644，miR-3976 和 miR-4306)高表達(dá)，可達(dá)到區(qū)分胰腺癌與健康人及良性胰腺疾病的目的。Que等［3］發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者miR-17-5p和miR-21的含量顯著升高，尤其是高水平的miR-17-5p可能與胰腺癌的轉(zhuǎn)移有顯著關(guān)系。Costa-Silva等［4］認(rèn)為，巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibi-tory factor，MIF)可能是胰腺導(dǎo)管癌發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的預(yù)后指標(biāo)。

1.1.2 肝癌:Sohn等［5］對肝癌和乙肝患者血清來源外泌體的miRNA進(jìn)行了對比，發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清外泌體中miR-18a，miR-221，miR-222和miR-224的含量明顯高于乙肝組，而 miR-101，miR-106b，miR-122和miR-195含量則明顯降低。Sugimachi等［6］則發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清外泌體中miR-718與正常人相比顯著下降。以上都提示這些miRNA可能作為肝癌診斷和判斷預(yù)后的標(biāo)志物。

He等［7］在肝癌細(xì)胞侵襲性的研究中發(fā)現(xiàn)，MET蛋白可能在肝癌侵襲中發(fā)揮重要作用，攝取其外泌體后的非侵襲細(xì)胞侵襲力增強(qiáng)。這提示MET可能成為預(yù)測肝癌轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物。

1.1.3 胃癌:Li等［8］在關(guān)于胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，LINC00152在胃癌患者血清來源外泌體中高表達(dá)，顯著高于胃上皮異型增生組與健康人，且手術(shù)后有明顯降低。LINC00152具有胃癌診斷的潛能。

1.1.4 腸癌:Ogata-Kawata等［9］的研究結(jié)果顯示7種 miRNA(let-7a，miR-1229，miR-1246，miR-150，miR-21，miR-223和miR-23a)在大腸癌患者血清外泌體中高表達(dá)并顯著高于健康對照組，且在手術(shù)前后含量水平有明顯改變。其中的miR-23a和miR-1246靈敏度很高，高于現(xiàn)用腫瘤標(biāo)志物CA-199和CEA，可作為大腸癌的診斷標(biāo)志物。Matsumura等［10］指出miR-19a在原發(fā)性腸癌的早期就開始高表達(dá)，并且miR-19a高表達(dá)患者的預(yù)后更差。

據(jù)Tauro研究［11］，在突變型結(jié)腸癌細(xì)胞分泌的外泌體中EpCAM，CLDN7和CD44等蛋白高表達(dá)，這些蛋白能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長和擴(kuò)散。Yoshioka等［12］認(rèn)為外泌體 CD147可替代 CA-199和CEA成為新的結(jié)直腸癌腫瘤標(biāo)志物。

1.2 呼吸系統(tǒng) 肺癌:Cazzoli等［13］對血液外泌體中的miRNA進(jìn)行了大量比對分析，結(jié)果顯示有4種 miRNA(miR-378a，miR-379，miR-139-5p 和 miR-200b-5p)可將肺癌和肺肉芽腫患者與健康人群區(qū)分開，可作為肺癌的篩查標(biāo)志物;而有6種miRNA(miR-151a-5p，miR-30a-3p，miR-200b-5p，miR-629，miR-100和miR-154-3p)可有效區(qū)分肺癌和肺肉芽腫患者，可作為肺癌的診斷標(biāo)志物。Munagala等［14］作了外泌體miRNA用于肺癌復(fù)發(fā)診斷的研究，他們發(fā)現(xiàn)miR-21和miR-155在原發(fā)性肺癌和復(fù)發(fā)性肺癌患者中水平有顯著差異，是肺癌復(fù)發(fā)診斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

除了miRNA，蛋白質(zhì)也在肺癌診斷中起重要作用。據(jù)研究，血液來源外泌體高表達(dá)CD317、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)等，可用于診斷非小細(xì)胞肺癌［15］。

1.3 神經(jīng)系統(tǒng)

1.3.1 膠質(zhì)細(xì)胞瘤:Manterola等［16］研究發(fā)現(xiàn)多形性惡性膠質(zhì)瘤的患者血清外泌體中有7種miRNA(miR483-5p，miR-574-3p，miR-320，miR-197，miR-484，miR-146a和miR-223)和1種snctRNA(RNU6-1)的表達(dá)水平與正常人相比有顯著差異，并且RNU6-1與miR-574-3p，miR-320聯(lián)合應(yīng)用，可作為多形性惡性膠質(zhì)瘤早期診斷的生物標(biāo)志物，具有較高靈敏度和特異度。

1.3.2 阿爾茨海默病:Lugli等［17］通過分析阿爾茨海默病患者血清來源外泌體miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-342-3p的下調(diào)可作為診斷老年癡呆的獨立生物學(xué)標(biāo)志物。

1.3.3 帕金森病(PD):Dong等［18］將實驗者按年齡、疾病分期、左旋多巴劑量、性別等配對分析后發(fā)現(xiàn)，DJ-1在PD患者尿外泌體中水平與非PD患者有明顯差異，說明尿外泌體DJ-1蛋白質(zhì)可作為PD診斷的潛在標(biāo)志物。

1.3.4 多發(fā)性骨髓瘤:Roccaro等［19］運用 micro RNA芯片和蛋白質(zhì)組學(xué)對多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-15a比健康人明顯下調(diào)，而 IL-6，CCL2和 fibronectin明顯上調(diào)，它們可以作為多發(fā)性骨髓瘤的診斷標(biāo)志。

1.4 心血管系統(tǒng) 心肌梗死:Matsumoto等［20］采集了有急性心肌梗死病史的患者血清，檢測發(fā)現(xiàn)miR-192的水平明顯上升，并且與心肌梗死后心力衰竭狀態(tài)有相關(guān)性。

1.5 泌尿系統(tǒng)

1.5.1 急性腎損傷:Chen等［21］發(fā)現(xiàn)，急性腎損傷患者尿液外泌體中激活轉(zhuǎn)錄因子3(activating transcription factor 3)的水平是正常對照組的約60倍，提示其具有特異性診斷標(biāo)志物的潛力。

1.5.2 慢性腎病:Lu等［22］運用RT-PCR檢測慢性腎病患者尿液外泌體中的miRNA，結(jié)果顯示miR-29，miR-200相比于健康人有明顯下降。并且miR-29a和miR-29c與慢性腎臟病患者腎小管間質(zhì)纖維化密切相關(guān)，可以區(qū)分中度和重度腎纖維化。Lu等［23］的研究還發(fā)現(xiàn)，腎病患者尿外泌體中CD2相關(guān)蛋白mRNA(CD2AP mRNA)水平隨著尿蛋白增加而下降，與腎纖維化程度呈負(fù)相關(guān)。

1.5.3 糖尿病腎病:Barutta等［24］對1型糖尿病早期腎損傷患者尿外泌體的miRNA進(jìn)行基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)miR-145較無腎損傷組表達(dá)升高。他們還在動物試驗中發(fā)現(xiàn)高糖刺激腎小球系膜細(xì)胞后，尿外泌體中的miR-145含量升高，驗證了miR-145有可能取代尿微量蛋白成為糖尿病腎病早期診斷的新標(biāo)志物。

Kalani等［25］的研究發(fā)現(xiàn)尿外泌體蛋白WT1在糖尿病患者中蛋白尿組和非蛋白尿組的水平有明顯差異，可作為診斷早期糖尿病腎病的生物標(biāo)志物。

1.5.4 狼瘡性腎炎:Sole等［26］發(fā)現(xiàn)尿外泌體中的miR-29c能很好地預(yù)測狼瘡性腎炎腎纖維化的程度。

1.5.5 多囊腎:Hogan等［27］對多囊腎患者尿外泌體蛋白質(zhì)譜的研究發(fā)現(xiàn)，與多囊腎病理過程相關(guān)的多囊蛋白質(zhì)1(PC1)和多囊蛋白質(zhì)2(PC2)減少約一半，而跨膜蛋白質(zhì)2(TMEM2)升高了約兩倍，所以推測尿外泌體PC1/TMEM2及PC2/TMEM2的比值可用于診斷多囊腎。

1.6 男性生殖系統(tǒng) 前列腺癌:Huang等［28］對前列腺癌患者血清外泌體中miRNA進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)miR-1290和miR-375呈高表達(dá)，與患者生存期密切相關(guān)，且可作為難治性前列腺癌的診斷標(biāo)記物。Li等［29］的研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌患者外泌體miR-141水平顯著高于良性前列腺疾病患者，而且轉(zhuǎn)移性前列腺癌中miR-141水平明顯高于非轉(zhuǎn)移性前列腺癌。另外，Isin等［30］對前列腺癌患者尿外泌體的組分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)miR-107和miR-574-3p比正常組上升，linc RNA-p21水平在兩組間有顯著差異，這些RNA對于前列腺癌的診斷和預(yù)測都有幫助。

Bijnsdorp等［31］發(fā)現(xiàn)，相比良性前列腺增生及前列腺癌，轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者尿外泌體中含有更高濃度的遷移侵襲相關(guān)的蛋白質(zhì)，如整合素α-3(ITGA3)及整合素 β-1(ITGB1)，ITGA3及 ITGB1可作為轉(zhuǎn)移性前列腺癌的蛋白標(biāo)志物。

1.7 女性生殖系統(tǒng) 卵巢癌:Meng等［32］對卵巢癌患者血清外泌體中miRNA進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)腫瘤組 miR-373，miR-200a，miR-200b 和 miR-200c水平比良性疾病和健康組顯著升高，并且 miR-200a，miR-200b和miR-200c可能與患者生存率相關(guān)。

2 外泌體用于疾病臨床治療的相關(guān)研究進(jìn)展

2.1 作為基因和藥物運送載體 外泌體可以攜帶許多重要分子，如:脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、基因等進(jìn)入受體細(xì)胞，從而影響受體細(xì)胞的生理病理過程。基于以下優(yōu)勢，外泌體成為眾多學(xué)者心中理想的基因和藥物運送載體。①天然無毒:相對于其他運載體，外泌體具有較低免疫原性，載體不會造成治療性物質(zhì)在肝臟的累積，無毒，不會出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)。另外，外泌體表面表達(dá)有CD55及CD59，能避免調(diào)理素、補(bǔ)體或凝血因子等的激活，具有較低免疫原性。②穩(wěn)定:外泌體外有雙層脂質(zhì)膜保護(hù)，其內(nèi)容物不易被各種酶降解，能高效穩(wěn)定的將裝載物運送到目標(biāo)組織。③納米級:外泌體直徑在40～100 nm之間，可以避免巨噬細(xì)胞(可吞噬超過100 nm的顆粒)的吞噬，而且能自由穿透血管進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)揮作用。④具有穿透生物屏障的能力:外泌體有能力穿過具有多層結(jié)構(gòu)的血腦屏障，其機(jī)制可能與其在細(xì)胞之間通過多囊泡體進(jìn)行傳遞有關(guān)［33］。⑤有歸巢靶組織的能力:外泌體具有的靶向性與其來源細(xì)胞有關(guān)，因為外泌體可以選擇性地富集來源細(xì)胞上構(gòu)象相同的跨膜蛋白，這些跨膜蛋白可以結(jié)合歸巢肽，使其具有定向歸巢能力［34］。另外，還能人為對外泌體進(jìn)行膜修飾從而增強(qiáng)其細(xì)胞特異性靶向作用。⑥有類似病毒侵入受體細(xì)胞的高效機(jī)制。⑦有多種方法裝載基因和藥物:常用裝載方法有:1)對外泌體來源細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)染或?qū)⒀b載物與來源細(xì)胞共孵育，使來源細(xì)胞分泌出有裝載物的外泌體。2)利用電穿孔、化學(xué)轉(zhuǎn)染、共孵育或反復(fù)凍融等方法直接把基因或藥物轉(zhuǎn)入外泌體。

近年來已有許多用外泌體實現(xiàn)靶向運送的報道:2013年，Aucher等［35］利用外泌體將人巨噬細(xì)胞來源的miR-142和miR-223轉(zhuǎn)移給肝癌細(xì)胞，成功抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖和生長，為肝癌的治療提供了新方法。2014年，Tian等［36］在外泌體表面展示了一個能靶向腫瘤血管的小肽，并裝載了化療藥物阿霉素。修飾后外泌體成功將阿霉素運送到乳腺癌組織中，抑制了小鼠腫瘤的生長。2015年，Yang等［37］借助腦內(nèi)皮細(xì)胞外泌體攜帶抗腫瘤藥物，實現(xiàn)了藥物順利通過血腦屏障發(fā)揮抑制腦腫瘤的作用。

2.2 抑制外泌體數(shù)量和作用 外泌體在介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中起重要作用，因此抑制外泌體的分泌或攝取，成為一種新的抗癌策略。Marleau等［38］就提出體外過濾外周血中的外泌體可作為肺癌治療的新療法。Fabbri等［39］也發(fā)現(xiàn)使用中性鞘磷脂酶抑制劑GW4869能抑制小鼠體內(nèi)外泌體的產(chǎn)生，并減少肺癌的轉(zhuǎn)移。

2.3 人為干預(yù)外泌體以增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫 上調(diào)外泌體特定內(nèi)容物的表達(dá)可以增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫。李秋文等［40，41］的研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙?；敢种苿㎝S-275和抗癌藥物可促進(jìn)Hep G2或Hep3B細(xì)胞分泌攜帶有HSP70，HLA-Ⅰ和CD80等蛋白的外泌體，它能誘導(dǎo)免疫細(xì)胞活性，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫。

2.4 有望開發(fā)成腫瘤疫苗 Gorete等［42］發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞被肺癌細(xì)胞相關(guān)抗原刺激后能產(chǎn)生攜帶有特異癌抗原的外泌體，這些外泌體遷移到區(qū)域淋巴結(jié)，可激活CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的抗腫瘤免疫反應(yīng)，起到類似疫苗的作用。因此，開發(fā)以外泌體為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗是癌癥治療的新思路。