磺胺甲噁唑和磺胺嘧啶在青石斑魚組織中的分布及代謝規(guī)律

鄧建朝，丁軍偉,2，楊賢慶,*，李來好，胡 曉，吳燕燕，陳勝軍，楊少玲，趙慶志,2

（1.中國水產科學研究院南海水產研究所，農業(yè)部水產品加工重點實驗室，廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306）

磺胺類藥物是對氨基苯磺酸的衍生物，具有抗菌譜廣、抗菌作用強、價格低廉等優(yōu)點，一直被廣泛應用于水產養(yǎng)殖動物疾病防治[1-2]。由于磺胺類藥物的廣泛應用，造成其在環(huán)境和食品中殘留較為普遍。例如，磺胺類藥物在食品中的超標率為20%，較喹諾酮類、氯霉素、四環(huán)素等超標率高[3]；磺胺類藥物的大劑量使用和不遵守休藥期的規(guī)定，已經導致可食性水產動物組織中殘留超標的現(xiàn)象。磺胺類藥物在動物的存在可能會對健康產生影響，已成為一個公共衛(wèi)生問題?；前奉愃幬锏臑E用，可能導致引起人體的過敏、致癌病菌的抗藥性[4-6]。并且，磺胺類藥物的代謝產物可能比磺胺類藥物毒性更大，其代謝產物殘留將通過食物鏈在人體內積累，對人體造成很大危害[7-8]。

石斑魚肉質細嫩鮮美，類似雞肉，所以有“海雞肉”之稱。而且石斑魚又是一種低脂肪、高蛋白的食用魚，被港澳地區(qū)推崇為我國四大名魚之一。石斑魚中含有的8 種人體必需氨基酸，苯丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸和色氨酸占總氨基酸的43.4%，比優(yōu)質的淡水魚高出6%～10%[9]。隨著人們生活水平的提高，肉質肥厚、味道鮮美、營養(yǎng)價值高的石斑魚需求量正在逐年增加[10]，石斑魚通過活體運輸銷往全國各地[11]，因此，保障石斑魚質量安全顯得尤為重要。

關于藥物代謝規(guī)律方面的研究，國外有關于磺胺類藥物在大西洋鮭魚[12-13]、虹鱒[14]、南美白對蝦[15]、大馬哈魚[16]等魚體內的代謝規(guī)律研究，國內有在大菱鲆[17]、對蝦[18-19]、羅非魚[20-21]的藥代動力學研究報道。但磺胺類藥物在鲆鰈類的代謝動力學研究鮮有報道。目前，磺胺甲噁唑（sulfamethoxazole，SMZ）、磺胺嘧啶（sulfadiazine，SDZ）是最經常被檢測到超標的兩種磺胺類藥物[1]。因此，本實驗研究了SMZ和SDZ在高值養(yǎng)殖品種青石斑體內的代謝和消除規(guī)律，以期為SMZ和SDZ在青石斑魚疾病控制、合理使用及休藥期提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青石斑魚，平均體質量（45.0±5.0）g，購買于深圳市大鵬鎮(zhèn)某養(yǎng)殖場[22]。

甲酸、乙腈（均為色譜純） 美國Thermo Fisher公司；實驗用水為MiliQ超純水；SMZ、SDZ和內標磺胺多辛（sulfadoxinc，SDX-D3） 美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑為分析純 廣州化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀 美國Waters公司；自動平衡離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；超純水器 美國Millipore公司；研磨儀 上海萬柏生物科技有限公司；T25勻漿機 德國TKA公司；3k30冷凍離心機 德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑的配制

酸化乙腈：99 mL乙腈中加入1 mL甲酸；0.1%的甲酸：將0.5 mL的甲酸用超純水定容到500 mL，然后超聲和抽濾。

1.3.2 樣品采集

配制含SMZ和SDZ的飼料，含量分別為200 mg/kg。青石斑魚被放入網箱（1.5 m×1.5 m×1.2 m）里養(yǎng)殖，養(yǎng)殖溫度約為（25±2）℃，pH 7.5～8.0，鹽度30‰～32‰，溶解氧為6.9～7.3 mg/L[23]。實驗組分為2 個平行的給藥組和一個空白對照組，每組實驗有青石斑魚300 尾，給藥前3 d停飼。投喂含藥飼料的量約為青石斑魚體質量的1%。實驗組單次投喂含磺胺類藥物劑量200 mg/kg的拌藥飼料，空白組投喂不含藥磺胺類藥物的飼料。分別于給藥后0、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48、72、96、120 h和144 h在每組采集6 條青石斑魚，然后取其背部肌肉、魚鰓、肝臟、血漿和腎臟，將處理好的樣品置于-20 ℃冰箱中保存。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：35 ℃；進樣量：10.0 μL；流速：0.35 mL/min；流動相：0.1%的甲酸（A）和乙腈（B）。梯度洗脫條件：0～0.5 min，5% B；0.5～1.8 min，5%～40% B；1.8～3.5 min，40%～90% B；3.5～4.0 min，90% B；4.0～4.5 min，90%～5% B；4.5～6.0 min，5% B。

1.3.4 質譜條件

離子源：電噴霧電離正離子模式掃描；離子源溫度：150 ℃；毛細管電壓：2.5 kV；脫溶劑氣溫度：400 ℃；脫溶劑氣流量：700 L/h；碰撞氣流速：0.15 mL/min，錐孔反吹氣流量：40 L/h；檢測方式：多反應監(jiān)測模式。母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量條件見表1。

表1 SMZ、SDZ、SDX-D3的質譜條件Table1 Mass spectrometric parameters for SMZ, SDZ and SDX-D3

1.3.5 樣品處理方法

參考農業(yè)部1077號公告—1—2008《水產品中17 種磺胺類及15 種喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法》[24]，優(yōu)化后使用。

血漿樣品：取2.0 mL血漿至50 mL離心管中，加入10 mL酸化乙腈、3.0 g無水硫酸鈉和100 μL 1 μg/mL SDX-D3內標，渦旋30 s，超聲20 min，5 000 r/min離心5 min，定容，取上清液，40 ℃水浴下氮氣吹干。用1.5 mL 1‰甲酸-10%乙腈溶液溶解，然后冷凍離心，過0.22 μm濾膜后，上機檢測。

1.3.6 標準曲線的制備

200 μg/mL SMZ和SDZ標準儲備液：分別稱取10.0 mg SMZ和SDZ，用甲醇溶解，定容于50mL容量瓶中，于0～4 ℃避光存放；SMZ和SDZ標準工作液：準確吸取適量SMZ和SDZ標準儲備液，配制質量濃度為10、20、50、100、500 ng/mL和2 000 ng/mL的標準工作液，繪制標準曲線。

1.3.7 回收率的測定

將已知質量濃度的SMZ和SDZ標準溶液加入空白青石斑魚各組織（2 g肌肉、2 g肝臟、2 g鰓、2 mL血漿和1 g腎臟），使SMZ和SDZ在各組織加標質量濃度分別為10、100、500 μg/kg或μg/L，每個平行設一個空白對照樣，每個添加量做4 個重復，按照1.3.5節(jié)方法進行處理，測定該方法的平均回收率和精密度。

1.4 數(shù)據處理

實驗所得數(shù)據采用Microsoft Excel 2010處理，繪制藥-時曲線，求出消除速率常數(shù)（β）和消除曲線方程，計算消除半衰期（t1/2）。

2 結果與分析

2.1 線性范圍及回收率

SMZ和SDZ在10～2 000 ng/mL質量濃度范圍內線性關系良好，線性方程分別為Y=0.557 3X＋2.318 8，Y=0.399 2X＋2.210 9（Y為質量濃度，X為峰面積），相關系數(shù)r分別為0.998 4和0.999 2。

表2 SMZ和SDZ在青石斑魚各組織中的回收率（n=4）Table2 Recoveries of SMZ and SDZ in spiked tissues of yellow grouper (n=4)

從表2可以看出，將已知質量濃度的SMZ和SDZ加入空白樣品中，使樣品中質量濃度為10、100、500 μg/kg或μg/L，各組織的平均加標回收率為85.5%～99.1%，相對標準偏差為2.1%～7.4%。而空白樣品中，青石斑魚背肌、肝臟、鰓、血漿和腎臟中的SMZ和SDZ的含量均低于定量限2 μg/kg。

2.2 SMZ和SDZ吸收和分布

表3 青石斑魚各組織中SMZ和SDZ的最大含量和對應的時間Table3 Cmax and Tmax of SMZ and SDZ in various tissues of yellow grouper

從表3可以看出，對于SMZ而言，在停止投喂含藥飼料3 h后，背肌、肝臟、鰓和腎臟的最大含量分別為776.70、827.97、345.18 μg/kg和432.14 μg/kg；血漿中SMZ的最大質量濃度出現(xiàn)在4 h后，為610.29 μg/L。對于SDZ而言，在停止投喂含藥飼料3 h后，背肌、肝臟和腎臟的最大含量分別為660.55、895.30 μg/kg和310.67 μg/kg；鰓中SDZ的最高含量出現(xiàn)在2 h，為431.88 μg/kg；血漿中SDZ最高質量濃度出現(xiàn)在4 h，為419.56 μg/L。

按各200 mg/kg SMZ和SDZ的劑量單次投喂石斑魚，SMZ在青石斑魚各組織中的含量的高低順序依次為肝臟、背肌、血漿、腎臟和鰓。SDZ在石斑魚各組織中的含量的高低順序依次為：肝臟、背肌、鰓、血漿和腎臟。肝臟中的SMZ和SDZ的最高含量在青石斑魚中較其他組織高。對于SMZ而言，肝臟中SMZ的含量是鰓的2.4 倍，是腎臟的1.9 倍，是血漿的1.4 倍，是背肌的1.1 倍。對于SDZ而言，肝臟中SDZ的含量是腎臟的2.9 倍，是血漿的2.1 倍，是鰓的2.1 倍，是背肌的1.4 倍。這一結果和SDZ在吉富羅非魚肝臟中含量最高類似[25]。

從圖1可以得出，在水溫為（25±2）℃時，SMZ和SDZ各200 mg/kg的劑量單次投喂石斑魚后，發(fā)現(xiàn)SMZ和SDZ在其背肌、肝臟、鰓、腎臟、血漿組織中的藥-時曲線都有雙峰現(xiàn)象，而且肝臟的含量最高。這可以推出SMZ和SDZ在石斑魚肝臟中有“首過效應”的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象也出現(xiàn)在SDZ在虹鱒魚[26]和歐洲鰻鱺[27]的體內消除規(guī)律中。但是磺胺二甲嘧啶在大菱鲆的體內沒有發(fā)現(xiàn)雙峰現(xiàn)象[28]。SMZ和SDZ的藥時曲線的首次峰值之后藥物含量快速下降，之后又形成第2個峰值，并且第1個峰值的含量比第2個峰值含量高。這可以推出SMZ和SDZ在石斑魚中存在肝-腸循環(huán)，這種現(xiàn)象同時出現(xiàn)在SMZ在鯽魚[29]和松浦鏡鯉[30]體內的消除階段。

圖1 SMZ和SDZ在青石斑魚各組織中的藥-時曲線Fig. 1 Time- and concentration-dependent curves of SMZ and SDZ in various tissues of yellow grouper

按SMZ和SDZ各200 mg/kg的劑量同時單次投喂石斑魚，72 h后SMZ和SDZ在石斑魚的背肌、肝臟、鰓、血漿和腎臟中的含量小于國家允許殘留限量0.1 mg/kg；144 h后，SMZ和SDZ在石斑魚的背肌、肝臟、鰓、血漿和腎臟含量均小于10 μg/kg。因此，在本實驗條件下，建議休藥期不低于3 d。

2.3 SMZ和SDZ各組織的消除半衰期

表4 SMZ和SDZ在青石斑魚各組織中的消除方程與消除參數(shù)Table4 Equations of elimination curves with parameters of SMZ and SDZ in various tissues of yellow grouper

從表4可以得出，SMZ和SDZ在青石斑魚各組織中的消除半衰期在16.90～31.50 h之間。SMZ和SDZ在石斑魚的肝臟中半衰期最短，代謝速度最快；在腎臟中半衰期最長，代謝速度最慢。由于SMZ的辛醇水分配系數(shù)lgKow（0.659）大于SDZ的lgKow（-0.074），SMZ的親水性小于SDZ。先前的研究發(fā)現(xiàn)對于辛醇水分配系數(shù)lgKow小于3的物質，辛醇水分配系數(shù)越小，他的排泄率可能越低[1]，因此，SMZ在青石斑魚的各組織中代謝速度都比SDZ要快。

3 討 論

磺胺類藥物為農業(yè)部批準水產養(yǎng)殖用藥，自從被廣泛應用于水產養(yǎng)殖業(yè)以來，為水產業(yè)的發(fā)展作出了突出貢獻。但是磺胺類藥物一旦被濫用，將造成在水產品中過量殘留，通過食物鏈直接被人體攝入并蓄積，蓄積含量超過一定程度，將對人體機能造成損害。因此，各國對磺胺類藥物在動物源食品中的殘留量做出了嚴格規(guī)定。美國食品藥品監(jiān)督管理局、歐盟及我國農業(yè)行業(yè)標準（NY 5070—2002《無公害食品水產品中漁藥殘留限量》）規(guī)定在可食性動物源食品中，磺胺藥物總計最大殘留限量為0.1 mg/kg。2015年以來，美國食品藥品監(jiān)督管理局加強了對進口我國水產品中的磺胺類藥物殘留檢測，曾報道從我國進口水產品中，有7 批次磺胺類藥物超標，這對我國水產品出口美國造成重大影響。

本實驗SMZ和SDZ在肌肉等各個組織中要降到0.1 mg/kg需要3 d。袁科平等[20]研究SMZ在羅非魚體內代謝規(guī)律發(fā)現(xiàn)，在（19±1）℃水溫條件下，單次口灌100 mg/kg SMZ，給藥10 d后，肌肉中SMZ含量低于0.1 mg/kg。孫玉增等[31]研究磺胺甲基異唑在大菱鲆體內的代謝規(guī)律，在（11±1）℃水溫條件下，單次口灌100 mg/kg SMZ，給藥后5 d后，肌肉中SMZ含量低于0.1 mg/kg。韓冰等[30]研究復方SMZ在松浦鏡鯉體內消除規(guī)律發(fā)現(xiàn)，每天一次連續(xù)5 d給藥后，SMZ于第9天開始低于0.10 mg/kg?？紤]到本實驗為單次用藥，用藥濃度和用量較短，因此，青石斑魚肌肉降低到0.1 mg/kg所需時間較低。根據我國SC/T 1084—2006《磺胺類藥物水產養(yǎng)殖使用規(guī)范》規(guī)定，石斑魚類推薦劑量口服磺胺類藥物的休藥期為15 d。由于水生動物體種類、水溫、用藥濃度等條件均可影響藥物的消解速率，對水生動物體內的藥物代謝消除影響非常顯著，因此在現(xiàn)實生產中要根據實際情況靈活把握休藥期。

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