馬 婧， 楊系玲， 孫 聰， 范文艷， 戴凌燕， 金麗娜， 宮占元， 貝麗霞， 姜述君

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江大慶 163319； 2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶 163319)

老山芹(HeracleummoellendorffiiHance)屬傘形科多年生草本植物，為藥食兩用植物，其幼嫩莖葉是美味的山野菜，具有極高的經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)價(jià)值，同時(shí)其干燥根入藥作獨(dú)活[1]。獨(dú)活是我國(guó)常用的傳統(tǒng)中藥，廣泛用于風(fēng)寒濕痹、腰膝疼痛、感冒頭痛、痛瘡腫痛和慢性氣管炎的治療[1-3]。一些研究表明，老山芹含有檞皮素、山奈素和蕓香苷等黃酮類化合物[4]，此外還含有聚乙炔化合物[5]及佛手柑內(nèi)酯、茴芹內(nèi)酯、異茴芹內(nèi)酯等香豆素化合物[6]。研究表明，佛手柑內(nèi)酯具有顯著的抗癌作用[7-8]，因此，老山芹潛在藥用價(jià)值也不可忽視。由于老山芹種子萌發(fā)困難，導(dǎo)致老山芹的自然分布數(shù)量較少，分布片斷化明顯，從而使其開(kāi)發(fā)利用受到制約。在眾多生物技術(shù)中，植物組織培養(yǎng)技術(shù)是解決重要野生植物資源保護(hù)和可持續(xù)發(fā)展的重要手段之一。

玻璃化現(xiàn)象是植物組織培養(yǎng)中經(jīng)常發(fā)生的一種生理失調(diào)現(xiàn)象，并且嚴(yán)重影響組培體系的穩(wěn)定性。由于物種間在遺傳和代謝等方面的差異性，導(dǎo)致不同種類植物玻璃化苗在生理生化方面存在一定差異。如香草玻璃化苗的可溶性糖含量顯著降低[9]，而菊花玻璃化苗可溶性糖含量顯著高于正常苗[10]；蘋(píng)果玻璃化苗的葉片中赤霉素(GA)含量極顯著上升[11]，然而雜交山楊玻璃化苗的GA含量降低[12]。目前關(guān)于老山芹試管苗培育及其玻璃化方面的研究鮮有報(bào)道。本研究擬分析老山芹玻璃化試管苗生理生化特征的變化，以期為揭示老山芹試管苗玻璃化的發(fā)生機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為老山芹試管苗玻璃化的有效預(yù)防及恢復(fù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及培養(yǎng)

老山芹正常試管苗與玻璃化苗：由新梢莖段在MS基本培養(yǎng)基上初代培養(yǎng)得到初代苗，然后截取莖段，進(jìn)行2次增殖繼代培養(yǎng)獲得。繼代培養(yǎng)20 d后調(diào)查增殖苗數(shù)和增殖系數(shù)，35 d后調(diào)查玻璃化率。增殖培養(yǎng)基配方為1/2MS+1.2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+2.5%蔗糖。培養(yǎng)基pH值為6.5，培養(yǎng)室溫度為(25±2) ℃，光照時(shí)間為16 h/d，光照度為 35 μmol/(m2·s)。

1.2 生理生化指標(biāo)的測(cè)定

淀粉、可溶性蛋白、總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b、可溶性糖和丙二醛(MDA)含量及相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定參考蒼晶等的方法[13]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 老山芹正常苗與玻璃化苗增殖能力的比較

將老山芹玻璃化的試管苗進(jìn)行繼代培養(yǎng)后，其分化出的苗仍呈現(xiàn)出玻璃化狀態(tài)，玻璃化率顯著高于正常苗，而正常苗增殖后的玻璃化苗率僅為12.56%，可見(jiàn)老山芹玻璃化苗增殖能力顯著低于正常苗；老山芹正常試管苗的增殖系數(shù)為 5.52，而玻璃化苗的增殖系數(shù)為3.38，比正常苗的增殖系數(shù)降低38.77%(表1)。結(jié)果表明，在試管苗培養(yǎng)過(guò)程中，玻璃化現(xiàn)象的出現(xiàn)嚴(yán)重降低了老山芹試管苗的繁殖速度。

2.2 老山芹正常苗與玻璃化苗可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白含量及干物質(zhì)積累率的比較

由表2可以看出， 玻璃化苗的可溶性糖含量顯著高于正常苗，但其淀粉、可溶性蛋白含量及干物質(zhì)積累率顯著低于正常苗。正常苗的可溶性糖含量比玻璃化苗低17.09%；但正常苗的淀粉含量、可溶性蛋白含量、干物質(zhì)積累率分別比玻璃化苗高33.65%、30.09%、66.94%。這些結(jié)果說(shuō)明，玻璃化苗將光合產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化為淀粉的能力較正常苗下降了。

表1 老山芹正常苗與玻璃化苗增殖的差異

表2 老山芹正常苗與玻璃化苗的可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白含量及干物質(zhì)積累比較

2.3 老山芹正常苗與玻璃化苗葉綠素含量的比較

從表3可見(jiàn)，正常苗與玻璃化苗的總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b含量和葉綠素a/葉綠素b均存在顯著差異。正常苗的葉綠素a含量比玻璃化苗高42.68%，葉綠素b含量比玻璃化苗高52.17%，總?cè)~綠素含量比玻璃化苗高44.76%。而正常苗的葉綠素a/葉綠素b比玻璃化苗降低了6.18%。以上結(jié)果表明，老山芹玻璃化苗的光合能力與正常幼苗相比有所下降。

表3 老山芹正常苗與玻璃化苗葉綠素含量差異

2.4 老山芹正常苗與玻璃化苗葉片丙二醛含量、相對(duì)電導(dǎo)率及活性氧含量的比較

表4 老山芹正常苗與玻璃化苗丙二醛含量、相對(duì)電導(dǎo)率及活性氧差異

2.5 老山芹正常苗與玻璃化苗抗氧化酶活性的比較

由表5可知，老山芹玻璃化苗出現(xiàn)了抗氧化酶系統(tǒng)的失調(diào)。老山芹玻璃化苗抗氧化酶系統(tǒng)中的超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶、抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性顯著高于正常苗，上述4種抗氧化酶活性分別比正常苗提高了23.84%、44.41%、92.07%、26.64%。

表5 老山芹正常苗與玻璃化苗抗氧化酶活性的差異

3 討論

玻璃化現(xiàn)象是植物組織培養(yǎng)過(guò)程中最為常見(jiàn)一種生理障礙。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常苗相比，老山芹玻璃化苗的葉綠素、淀粉、可溶性蛋白含量和干物質(zhì)積累率均出現(xiàn)大幅度的降低，而可溶性糖含量卻比正常試管苗顯著增加。這些結(jié)果表明，老山芹玻璃化苗出現(xiàn)了光合作用失調(diào)和代謝紊亂現(xiàn)象。在本試驗(yàn)中，玻璃化老山芹的可溶性糖含量顯著高于正常苗，而網(wǎng)紋甜瓜[16]、滿天星[17]和藍(lán)莓[18]的玻璃化苗可溶性糖含量顯著低于正常苗，這種差異可能是由于不同植物種類對(duì)糖類吸收和利用方面存在差異造成的。