丁 威， 湯 靜， 周燕芬， 邢 軍

(1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇句容 212400； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇南京 210014)

卵泡閉鎖是卵巢卵泡發(fā)育過(guò)程中一種正常的生理現(xiàn)象，該現(xiàn)象受多種因素影響和調(diào)控，在哺乳動(dòng)物的一生中，最終只有少量卵泡發(fā)育為優(yōu)勢(shì)卵泡并排卵，而90%以上的卵泡將發(fā)生閉鎖[1]。營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境或毒理方面的因素可能會(huì)造成卵泡的大量閉鎖，從而影響動(dòng)物生產(chǎn)。在豬卵巢卵泡閉鎖過(guò)程中，顆粒細(xì)胞層逐漸脫落，未脫落的顆粒細(xì)胞比較飽滿，在高倍鏡下可清楚地見(jiàn)到凋亡的顆粒細(xì)胞核內(nèi)形成的凋亡小體。雖然從形態(tài)特征上能夠觀測(cè)到卵泡閉鎖的變化，但有關(guān)豬卵泡閉鎖的機(jī)制及其挽救措施仍有待研究。

大蒜素為天然存在于百合科植物大蒜(AlliumsativumL.)鱗莖中的一種具有抗癌活性的成分，為三硫代烯丙醚類(lèi)化合物，農(nóng)業(yè)上用作殺蟲(chóng)劑、殺菌劑[2-4]，也用于飼料生產(chǎn)、食品加工及藥品生產(chǎn)等方面。相關(guān)研究表明，大蒜素作為一種具有多種功能的飼料添加劑，既可以通過(guò)改善動(dòng)物機(jī)體內(nèi)各組織器官功能，強(qiáng)化胃腸道蠕動(dòng)與消化酶的代謝，增加畜禽及魚(yú)類(lèi)的采食，提高畜禽對(duì)飼料的消化利用，從而提高畜禽的生產(chǎn)性能[5]，又可以增強(qiáng)畜禽的免疫機(jī)能，從而預(yù)防多種疾病。但有關(guān)大蒜素對(duì)豬繁殖尤其是卵泡閉鎖的影響研究較少。

本試驗(yàn)應(yīng)用大蒜素對(duì)體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行處理，通過(guò)檢測(cè)處理后顆粒細(xì)胞的凋亡情況及類(lèi)固醇激素合成水平等，揭示大蒜素對(duì)豬卵巢卵泡顆粒細(xì)胞發(fā)育和功能的調(diào)控機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

從江蘇省南京市某生豬屠宰加工廠采集健康的豬卵巢作為試驗(yàn)材料。將采集后的卵巢迅速放入裝有含青霉素、鏈霉素的37 ℃生理鹽水的保溫杯中，于2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。從某飼養(yǎng)場(chǎng)采集梅山豬的卵巢組織，放于4%多聚甲醛中固定 36～48 h，用于免疫組織化學(xué)染色試驗(yàn)。

大蒜素購(gòu)于Sigma公司；DMEM/F-12細(xì)胞培養(yǎng)液、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、青霉素、鏈霉素購(gòu)于Life Technologies公司；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；細(xì)胞增殖試劑盒、免疫熒光試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的驢抗羊IgG購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；雌二醇和孕酮放射免疫(RIA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所；蘇木素染料購(gòu)自南京建成生物工程研究所；鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(SABC)試劑盒、3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 卵巢組織的免疫組織化學(xué)染色 參照丁威等的方法[6]對(duì)卵巢組織的免疫組織進(jìn)行化學(xué)染色。脫蠟止水：二甲苯Ⅰ 7 min→二甲苯Ⅱ 7 min→100%乙醇Ⅰ 5 min→100%乙醇Ⅱ 5 min→90%乙醇5 min→70%乙醇2 min→蒸餾水5 min；滅活內(nèi)源酶：用3%甲醇-H2O2處理15 min→蒸餾水5 min；抗原熱修復(fù)：檸檬酸三鈉(pH值=6.0)100 ℃ 10 min→PBS洗滌3次，每次3 min；加一抗：10%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，簡(jiǎn)稱(chēng)BSA)室溫封閉30 min→一抗加入后，須要在室溫條件下過(guò)夜，陰性對(duì)照可用1% BSA代替(cleaved-Caspase3抗體稀釋濃度為1 ∶200)PBS洗滌3次，每次3 min；SABC(strept avidin-biotin complex)反應(yīng)：二抗加入后，須要在室溫條件下30 min→PBS洗滌3次，每次3 min→加SABC，室溫15 min→PBS洗滌3次，每次3 min；顯色：0.05% DAB+0.01% H2O2，顯色2～10 min→水沖洗5 min→蘇木素復(fù)染→水沖洗5 min；脫水透明：50%乙醇2 min→70%乙醇2 min→90%乙醇2 min→100%乙醇Ⅰ 2 min→100%乙醇Ⅱ 2 min→二甲苯Ⅰ 4 min→二甲苯Ⅱ 4 min；封片，用光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，切片中棕褐色代表陽(yáng)性表達(dá)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 參照宋丹等的方法[7]對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和處理。在實(shí)驗(yàn)室中將從屠宰場(chǎng)采集來(lái)的卵巢用37 ℃生理鹽水清洗3次，然后用10 mL注射器從卵巢表面選擇直徑為3～5 mm的卵泡抽取卵泡液，放入離心管靜置10～15 min，1 500 r/min離心2 min，PBS洗3次后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。將顆粒細(xì)胞放入含10%胎牛血清、20 ng/mL促卵泡素(FSH)、100 mg/L鏈霉素和100 IU/mL青霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)液6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于5% CO2和37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后將顆粒細(xì)胞分成4組，第1組繼續(xù)用基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)作為對(duì)照，第2組為添加H2O2(100 μmol/L)處理、第3組為添加大蒜素(50 μmol/mL)處理、第4組為添加大蒜素(50 μmol/mL)+H2O2(100 μmol/L)處理，其中大蒜素固體溶解于PBS并添加到培養(yǎng)液中，終濃度為50 μmol/L。培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)液用于類(lèi)固醇激素水平測(cè)定。

1.2.3 類(lèi)固醇激素測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中的雌二醇(E2)和孕酮(P4)含量。E2和P4的靈敏度分別為<5 pg/mL和<0.2 ng/mL，批內(nèi)變異系數(shù)小于10%，批間變異系數(shù)小于15%。

1.2.4 DAPI凋亡檢測(cè) 用6孔板接種傳代豬顆粒細(xì)胞以制作細(xì)胞爬片并進(jìn)行相應(yīng)處理。細(xì)胞在蓋玻片上生長(zhǎng)融合到90%左右時(shí)從孵箱中取出，用預(yù)溫37 ℃ PBS洗3次，每次10 min，4%甲醛室溫固定30 min，PBS洗3次，每次10 min，然后用0.2% Triton X-100透化30 min，加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)孵育 10 min，PBS清洗3次，每次10 min，最后在激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 從對(duì)照、H2O2、大蒜素、大蒜素+H2O2等4組處理中分別取100 μL約2 000個(gè)顆粒細(xì)胞放入96孔板中，依據(jù)MTT試劑盒說(shuō)明書(shū)，每孔加入10 μL MTT溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，然后每孔再加入100 μL Formanzan溶解液繼續(xù)孵育4 h，直到在普通光學(xué)顯微鏡下能夠觀測(cè)到Formazan全部溶解，然后早570 nm處的測(cè)定溶液吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，然后用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著性比較采用Turkey檢驗(yàn)法，所有數(shù)據(jù)均用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，至少重復(fù)4次。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cleaved Caspase3蛋白在豬卵巢卵泡中表達(dá)的定位

魏全偉研究表明，Caspase3在由顆粒細(xì)胞凋亡引起卵泡閉鎖的過(guò)程中的表達(dá)存在顯著升高現(xiàn)象。為了進(jìn)一步研究Caspase3的激活(Cleaved Caspase3)在豬卵巢卵泡壁退化過(guò)程的作用，選取正在閉鎖的卵泡(即顆粒細(xì)胞正在凋亡和脫落的卵泡)進(jìn)行研究。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，隨著卵泡的閉鎖，顆粒細(xì)胞凋亡并脫落在卵泡腔內(nèi)，顆粒細(xì)胞凋亡伴隨著染色質(zhì)的濃縮。顆粒細(xì)胞的凋亡伴隨著Caspase3的激活(圖1-B、圖1-E)，而在健康的卵泡中幾乎不存在Caspase3的激活(圖1-A、圖1-D)。

2.2 顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中E2和P4激素水平變化

由圖2可知，氧化應(yīng)激組(過(guò)氧化氫處理)中的E2濃度顯著低于對(duì)照組、50 μmol/L大蒜素處理組及50 μmol/L大蒜素和過(guò)氧化氫共同處理組(P<0.05)；而氧化應(yīng)激組P4濃度顯著高于對(duì)照組、50 μmol/L大蒜素處理組及50 μmol/L大蒜素和過(guò)氧化氫共同處理組(P<0.05)。表明大蒜素可以提高顆粒細(xì)胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下雌二醇分泌能力，并抑制顆粒細(xì)胞黃體化。雌激素和孕激素可以作為檢測(cè)細(xì)胞狀態(tài)的指標(biāo)，結(jié)果表明，大蒜素處理下細(xì)胞狀態(tài)相對(duì)更好。

2.3 豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡情況

顆粒細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，將制作好的細(xì)胞爬片進(jìn)行DAPI染色，用激光共聚焦顯微鏡細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果(圖3)表明，與對(duì)照組相比，氧化應(yīng)激組大量細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)變化，而大蒜素處理組有效緩解了上述變化。細(xì)胞凋亡的典型特征包括細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)固縮、染色質(zhì)新月體形成、DNA片段化和凋亡小體形成等。

2.4 豬原代顆粒細(xì)胞的增殖情況

由圖4可知，與對(duì)照組相比，氧化應(yīng)激組顆粒細(xì)胞增殖活性顯著降低，而添加大蒜素與H2O2協(xié)同處理以后能夠顯著增加細(xì)胞增殖活性。該結(jié)果與凋亡檢測(cè)結(jié)果相一致。

3 討論

目前普遍的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為，卵泡閉鎖主要是由卵巢卵泡顆粒細(xì)胞凋亡引起的[8]。因此，顆粒細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制可能是研究卵泡閉鎖的重要突破點(diǎn)和關(guān)鍵點(diǎn)。目前有關(guān)大蒜素抑菌作用的研究較多，相關(guān)研究認(rèn)為，大蒜素可激活單核細(xì)胞的分泌水平，促使溶菌酶大量釋放，溶菌酶能水解細(xì)菌細(xì)胞壁中的粘多糖，使致病菌細(xì)胞破裂死亡，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫功能[9]。然而，有關(guān)大蒜素在顆粒細(xì)胞凋亡方面的研究較少。

免疫組織化學(xué)染色試驗(yàn)結(jié)果表明，卵泡閉鎖過(guò)程中顆粒細(xì)胞的凋亡激活了Caspase3；而前期研究認(rèn)為，Caspase3能夠進(jìn)一步解離PARP-1，而PARP-1的解離參與卵泡閉鎖過(guò)程[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素能夠作用于卵巢顆粒細(xì)胞，并緩解H2O2造成的顆粒細(xì)胞凋亡。

在卵泡發(fā)育過(guò)程中，顆粒細(xì)胞不斷增殖使得卵泡不斷生長(zhǎng)，并最終排卵[11-13]。顆粒細(xì)胞是卵巢中合成和分泌雌激素、孕酮等激素的主要功能細(xì)胞。多種哺乳動(dòng)物的卵巢生長(zhǎng)和卵泡發(fā)育均與卵巢的雌激素、孕激素分泌水平相關(guān)[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素可以改善氧化應(yīng)激狀態(tài)下卵巢顆粒細(xì)胞的內(nèi)分泌功能，表明大蒜素可用于豬生產(chǎn)，以提高豬抗應(yīng)激水平和調(diào)節(jié)卵巢發(fā)育。

本研究結(jié)果還表明，氧化應(yīng)激狀態(tài)下，顆粒細(xì)胞的增殖受到抑制，而大蒜素能夠在一定程度上提高顆粒細(xì)胞的增殖活性。該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明大蒜素對(duì)顆粒細(xì)胞內(nèi)分泌功能具有改善作用，為豬繁殖的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控提供參考。此外，應(yīng)用體外豬卵巢顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，本研究結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明大蒜素在抑制顆粒細(xì)胞凋亡過(guò)程中可能發(fā)揮著某種重要的作用，可為大蒜素在豬育種及生產(chǎn)過(guò)程提供有價(jià)值的參考依據(jù)。而相關(guān)作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究闡明。