王悅良，陳豪特，代 波，王權(quán)勝△

(1. 廣西中醫(yī)藥大學，南寧 530001； 2. 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，南寧 530023)

1 材料與方法

1.1 動物及分組

1.2 主要儀器

MACRO精子計數(shù)板和WLJY-9000型偉力彩色精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)，北京偉力新世紀科技發(fā)展有限公司；DL-4ZB 型低速自動平衡離心機，湖南星科科學儀器有限公司；掃描電子光學顯微鏡，由廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院病理科提供；廣西醫(yī)科大學電鏡室提供觀察分析服務。

1.3 藥物制備

1.3.2 邁之靈片 德國禮達大藥廠生產(chǎn)(注冊證號 Z20050017)，150 mg/片。

1.4 動物模型制作方法

將實驗大鼠用普通飼料飼養(yǎng)1周, 觀察無明顯異常后即進行造模，模型的制作方式參照Turner腎靜脈縮窄術(shù)[2]。SD大鼠以10%的水合氯醛腹腔肌注麻醉(1 ml/300 g)，麻醉成功后應用大鼠板固定。取大鼠劍突下腹部正中切口逐層切開，將腹內(nèi)容物輕推向右上腹，于左側(cè)腹膜后顯露左腎靜脈，游離部分左腎靜脈后，在左腎上腺靜脈與腹背靜脈之間的左腎靜脈放置一直徑約0.85 mm的金屬桿，以4-0的絲線將金屬桿與左腎靜脈一并結(jié)扎，結(jié)扎完成后小心抽出金屬桿，可見左腎靜脈恢復充盈擴張。觀察2 min，確定左腎無缺血后將腹內(nèi)容物歸位，并逐層縫合切口。于造模術(shù)后1個月麻醉解剖觀察，按照精索靜脈曲張模型建立成功的標志：左精索靜脈直徑>1 mm，測量直徑比假手術(shù)組擴張3倍以上，雙腎質(zhì)量無明顯差別即提示精索靜脈曲張性不育模型造模成功。假手術(shù)組只需進行左腎靜脈的剝離，不予結(jié)扎左腎靜脈。各組大鼠在術(shù)后5 d內(nèi)，每天肌注青霉素鈉40萬U/只。

1.5 給藥方法

2 觀察及檢測方法

2.1 標本的制作及觀察方法

于末次給藥后24 h各組大鼠稱重斷頸處死,剪開陰囊,各組大鼠均摘取左側(cè)睪丸組織,用冷生理鹽水沖洗,除去血液稱其質(zhì)量,迅速置于盛有6 mL生理鹽水的平皿內(nèi),適當加以剪碎置于約37℃溫水中溫浴20 min左右，輕輕搖晃混勻以使睪丸內(nèi)的精子充分游離,用精子計數(shù)板檢測精子濃度和活率。按《WHO人類精液及精子-宮頸黏液相互作用實驗室檢驗手冊》[3]標準測定精子質(zhì)量；將部分睪丸組織用Bouin’s液固定24 h,梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟切片包埋,HE染色,光鏡下觀察睪丸組織及生精上皮等改變；將大鼠睪丸組織切取約1 mm3大小放入2%戊二醛和1%多聚甲醛混合液中行固定處理后，送廣西醫(yī)科大學電鏡實驗室觀察其超微結(jié)構(gòu)。

2.2 大鼠睪丸組織顯微超微結(jié)構(gòu)檢測

光鏡下觀察各組附睪丸組織常規(guī)病理變化，如精子細胞、曲精小管、生精上皮等結(jié)構(gòu)變化；電鏡下觀察左側(cè)睪丸超微結(jié)構(gòu)改變，如生精上皮、間質(zhì)血管、支持細胞，主細胞溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等亞細胞結(jié)構(gòu)。

2.3 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 一般情況

3.2 左精索靜脈直徑及睪丸質(zhì)量量變化

模型組大鼠左精索靜脈直徑較假手術(shù)組明顯曲張,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。模型組大鼠左側(cè)睪丸質(zhì)量與假手術(shù)組左側(cè)睪丸質(zhì)量比較明顯減輕(P<0.05)；模型組大鼠右側(cè)睪丸質(zhì)量(1.79±0.05)g，相對假手術(shù)組(1.84±0.06) g差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；造模各組大鼠左側(cè)睪丸質(zhì)量較右側(cè)減輕明顯。

3.3 對睪丸精子質(zhì)量的影響

表1 各組大鼠附睪精子質(zhì)量比較

注:與模型組比較:▲P<0.05，▲▲P<0.01；與邁之靈組比較:△P<0.05

3.4 對大鼠睪丸顯微超微結(jié)構(gòu)的影響

注：A.假手術(shù)組;B.模型組; C.邁之靈組; D.大黃蟲丸組圖1 各組大鼠睪丸組織光鏡圖(HE染色 ×200)

注：A.假手術(shù)組;B.模型組; C.邁之靈組; D.大黃蟲丸組圖2 各組大鼠睪丸組織電鏡圖(×30000)

4 討論

精索靜脈曲張是青壯年男性的常見病和多發(fā)病，發(fā)病率約占男性人群的10%～15%，精索靜脈曲張可使睪丸內(nèi)環(huán)境發(fā)生病理改變，影響精子發(fā)生發(fā)育，造成精子濃度及活率下降，精子細胞形態(tài)上不成熟和畸形精子的數(shù)量顯著增多，從而影響男性不育[4]。但現(xiàn)代醫(yī)學界對精索靜脈曲張導致的男性不育機制尚未形成統(tǒng)一的認識，有報道指出精索靜脈曲張導致的不育可能與睪丸內(nèi)組織細胞凋亡、激素分泌、自身免疫、氧化應激等諸多因素相互作用致精子生成障礙有密切關(guān)聯(lián)[5-6]。本實驗通過對精索靜脈曲張模型大鼠睪丸精子濃度及活動率觀察并結(jié)合顯微超微結(jié)構(gòu)改變發(fā)現(xiàn)，大鼠精子質(zhì)量與睪丸內(nèi)環(huán)境的變化有某種必然的聯(lián)系。一方面，精索靜脈曲張可導致附睪血液滯留瘀積，回流緩慢，使睪丸組織缺血缺氧和必需的營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生供應障礙，致使生精上皮損傷，各級生精細胞發(fā)育成熟過程中出現(xiàn)獲能中斷，可致精子濃度降低，形態(tài)畸形率增加。另一方面，睪丸內(nèi)有毒物質(zhì)的異常蓄積，使血管內(nèi)皮受損及活性物質(zhì)異常釋放，促使某些誘導細胞凋亡的分子過度表達，改變睪丸組織顯微超微結(jié)構(gòu)、蛋白酶學的生成和分泌，影響精子發(fā)生發(fā)育環(huán)境的穩(wěn)定性。