金京順，焦淑婷，張楓燃，李海峰★

（1.吉林省延吉市動物疫病預(yù)防控制中心，吉林 延吉 133002；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系，吉林 延吉 133002）

大腸桿菌是引起豬腹瀉的主要致病菌之一，可引起不同年齡段的豬發(fā)生仔豬黃痢、仔豬白痢及豬大腸桿菌病，豬大腸桿菌病是影響?zhàn)B豬企業(yè)的重要腸道傳染病之一，常常造成養(yǎng)豬企業(yè)的重大損失，對養(yǎng)豬生產(chǎn)危害很大。近年來，延邊地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展勢頭良好，豬大腸桿菌病雖然得到一定控制，但在一些環(huán)境、飼養(yǎng)管理、衛(wèi)生條件較差的豬場仍時有發(fā)生，發(fā)病率可達(dá)30%～50%，嚴(yán)重制約該地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。本文對2017年1月至2018年5月延邊地區(qū)的延吉市、龍井市、圖們市的養(yǎng)豬場病死豬及疑似大腸桿菌感染的腹瀉病豬病料進(jìn)行了病原的分離及鑒定，為該病的診斷及防制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源

2017年1月～2018年5月，共采集了48份病料樣本，其中延吉市15份；龍井市22份；圖們市11份。

1.1.2 實驗動物

健康昆明種小白鼠由延邊大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.3 儀器設(shè)備

電熱恒溫培養(yǎng)箱（常州菲普實驗儀器廠）、超凈工作臺（大連金石實驗室設(shè)備有限公司）、全自動高壓滅菌鍋（日本ALP）、生物顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離、純化

將采集的樣本送往實驗室接種于普通肉湯中，37℃培養(yǎng)12～24h。從普通肉湯中取100μL菌液分別接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美蘭培養(yǎng)基，涂板培養(yǎng)，37℃，24h。挑取單個可疑菌落接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)。將純化的細(xì)菌保存，革蘭氏染色，鏡檢。

1.2.2 分離菌的生化鑒定

在超凈工作臺上，分別挑取各純培養(yǎng)物的單個菌落，進(jìn)行乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇生化、三糖鐵瓊脂試驗、硝酸鹽還原實驗、MR試驗、VP試驗等14項生化鑒定試驗。

1.2.3 致病性試驗

將分離菌株接種于營養(yǎng)肉湯，37℃，18h，將菌液稀釋成1010CFU/mL，試驗小白鼠分為試驗組和對照組，每個組5只小白鼠，試驗組小白鼠腹腔接種稀釋后的菌液，0.3mL/只；對照組小白鼠同時腹腔接種滅菌生理鹽水，0.3mL/只。各組小白鼠單籠隔離飼養(yǎng)，分別于24h、48h觀察小白鼠的狀態(tài)、是否發(fā)病，并做好記錄。

1.2.4 大腸桿菌血清型鑒定

參考方爽的方法進(jìn)行分離株大腸桿菌O抗原血清型分型。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)結(jié)果

純培養(yǎng)后的待檢菌株在麥康凱培養(yǎng)基上出現(xiàn)圓形、表面光滑、濕潤、稍凸起的菌落。菌落呈玫瑰紅色。而在伊紅美蘭培養(yǎng)基上生長的菌落，呈現(xiàn)黑色，略帶金屬閃光，符合大腸桿菌菌落特征。革蘭氏染色后，顯微鏡下可見紫紅色、著色均勻、單個或成對的無莢膜、無芽孢、兩端鈍圓的短桿菌。分離得到40株疑似菌株符合豬大腸桿菌形態(tài)特征。

2.2 生化鑒定結(jié)果

對分離得到的40株大腸桿菌菌株進(jìn)行生化試驗，結(jié)果表明，分離菌株均能使葡萄糖、乳糖和蔗糖發(fā)酵；甘露醇、麥芽糖試驗結(jié)果為產(chǎn)酸產(chǎn)氣；三糖鐵試驗底層產(chǎn)酸變黃；明膠液化試驗陰性、氧化酶試驗陰性、尿素酶試驗陰性；過氧化氫酶試驗陽性；MR試驗陽性；VP試驗陰性。以上生化試驗結(jié)果符合大腸桿菌的特征，表明分離到的菌株為大腸桿菌。

2.3 致病性試驗結(jié)果

36株大腸桿菌培養(yǎng)物接種后，試驗組小白鼠48h內(nèi)全部死亡；另外4株大腸桿菌培養(yǎng)物接種后，48h內(nèi)有1～2只小白鼠死亡，未死亡小白鼠精神狀態(tài)不佳，飲食飲水減少，出現(xiàn)腹瀉癥狀。而對照組的小白鼠未發(fā)生死亡，全部存活。對死亡的小白鼠進(jìn)行解剖，觀察病理變化，可見死亡小白鼠的肝臟腫大、質(zhì)地脆硬、心包膜增厚。取死亡小白鼠的肝臟，涂片染色，顯微鏡檢查，鏡下可見到典型的大腸桿菌。依此判斷本次分離到的40株大腸桿菌均有致病性，其中36株為高致病性菌株，4株為低致病性菌株。

2.4 血清型鑒定

對分離得到的40株大腸桿菌菌株分別進(jìn)行O抗原血清型鑒定，其中2株定型未成功，1株定型試驗發(fā)生自凝，其余37株分型成功，共鑒定出29個不同的血清型。其中O6（4/37），O 78（5/37）、O 90（7/37）、O 107（7/37）為優(yōu)勢血清型，占全部分離菌株的62.1%。

3 討論

大腸桿菌是各種動物腸道內(nèi)的常在菌，大腸桿菌血清型眾多，其抗原類型主要有K、O、H組成。據(jù)文獻(xiàn)報道，大腸桿菌在不同地區(qū)的血清型分布有很大的差異。本試驗結(jié)果顯示，延邊地區(qū)部分豬場此次分離到的大腸桿菌的優(yōu)勢血清型為O6、O78、O90、O107，本次分離菌株鑒定的血清型與國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報道的不同地區(qū)分離的豬源性大腸桿菌的血清型有一定的差異性。

大腸桿菌的抗原成分復(fù)雜，可分為菌體抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），后者有抗機體吞噬和抗補體的能力。根據(jù)O抗原對大腸桿菌進(jìn)行血清型分型，至今已發(fā)現(xiàn)170多種血清型。由于大腸桿菌血清型眾多，不同地區(qū)不同養(yǎng)殖場流行的菌株可能存在很大的差異，給大腸桿菌病的防制帶來了很大的困難。并且隨著時間和地域的變化，大腸桿菌可能會發(fā)生變異，出現(xiàn)新的血清型。本次調(diào)查中出現(xiàn)的未定型菌株，可能是大腸桿菌發(fā)生新的變化而出現(xiàn)的新血清型，對這些未定血清型菌株的毒力特征、致病性等應(yīng)引起重視，并開展相應(yīng)的研究工作。