邱夢君，熊枝繁，何曉曉，畢檸瑞，汪朦朦，楊盛力

(1華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院，武漢430077；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院；3華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院)

生物鐘是生物在漫長進化過程中形成的穩(wěn)定內(nèi)在生物節(jié)律，在分子水平上由許多生物鐘基因調(diào)控，如Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Timeless、CLOCK、BMAL1、NPAS2、NR1D1、NR1D2、DEC1和DEC2[1]。生物鐘基因在分子水平上協(xié)調(diào)表達，通過機體新陳代謝來調(diào)節(jié)細胞和器官的生長、衰老[2]。腫瘤的發(fā)生是由于機體在基因水平上失去了對細胞生長正常的調(diào)控作用，從而導(dǎo)致細胞增殖紊亂。生物鐘基因通過調(diào)控細胞增殖和凋亡，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮直接或間接作用[3]。2018年1～6月，本研究采用癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫分析生物鐘基因在腹部惡性腫瘤組織與鄰近正常組織中的表達差異，初步探討生物鐘基因在腹部惡性腫瘤中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 材料 從TCGA網(wǎng)站(https://cancergenome.nih.gov/)下載最新14個生物鐘基因(Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Timeless、CLOCK、BMAL1、NPAS2、NR1D1、NR1D2、DEC1、DEC2和RORA)在6種腹部惡性腫瘤(胃癌、胰腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、直腸癌和腎癌)組織中的RNA-Seq數(shù)據(jù)，包括371例份肝癌與50例份鄰近正常組織，538例份腎癌與72例份鄰近正常組織，478例份結(jié)腸癌與41例份鄰近正常組織，166例份直腸癌與10例份鄰近正常組織，375例份胃癌與32例份鄰近正常組織，177例份胰腺癌與4例份鄰近正常組織。

1.2 研究方法 用Bioconductor (http://www.bioconductor.org/)的edgeR去標(biāo)準(zhǔn)化RNA-Seq數(shù)據(jù)。惡性腫瘤組織和鄰近正常組織均以標(biāo)準(zhǔn)化RNA-Seq數(shù)據(jù)表達量的平均值為基礎(chǔ)，比平均值高的為高表達，比平均值低的為低表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件。生物鐘基因在惡性腫瘤組織與鄰近正常組織中的差異表達比較采用Pearson卡方檢驗。采用GraphPad Prism5對數(shù)據(jù)進行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

在不同的腹部惡性腫瘤組織中，生物鐘基因表達不一。14個生物鐘基因在肝癌、腎癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胃癌組織中均低表達，其中Cry2、CLOCK、Timeless、NPAS2、NR1D1、DEC1、DEC2、RORA在肝癌組織中的表達低于其鄰近正常組織(P均<0.05)，Per1、Per2、Cry1、Cry2、CLOCK、Timeless、NPAS2、NR1D1、NR1D2、DEC2、RORA在腎癌組織中的表達低于其鄰近正常組織(P均<0.05)，Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Timeless、BMAL1、NR1D2、DEC1、DEC2、RORA在結(jié)腸癌組織中的表達低于其鄰近正常組織(P均<0.05)，Per1、Per3、Cry1、Cry2、CLOCK、BMAL1、NPAS2、NR1D1、DEC2、RORA在直腸癌組織中的表達低于其鄰近正常組織(P均<0.05)，Per1、Per3、Cry2、CLOCK、Timeless、BMAL1、NPAS2在胃癌組織中的表達低于其鄰近正常組織(P均<0.05)。14個生物鐘基因在胰腺癌組織的表達與其鄰近正常組織比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

3 討論

生物鐘是通過參與生理、生化、行為過程而獲得的、調(diào)控機體晝夜周期的內(nèi)在系統(tǒng)[4]，包括中樞生物鐘和外周生物鐘。中樞生物鐘是節(jié)律的起點，可自主產(chǎn)生并維持日周期節(jié)律，由此發(fā)出的信息控制機體的生理節(jié)律，包括睡眠覺醒、血壓、心率、呼吸、體溫、臟器活動、激素和神經(jīng)內(nèi)分泌活動、細胞分裂等。外周生物鐘受中樞生物鐘直接或間接控制，但在失去中樞生物鐘的控制后，外周生物鐘亦可以獨立啟動，表現(xiàn)為細胞代謝和增殖的晝夜節(jié)律[5，6]。生物鐘基因通過調(diào)節(jié)許多下游基因來影響細胞的生命。在哺乳動物的基因組中，生物鐘基因調(diào)控2%～10%基因的表達，這些基因被稱為時鐘控制基因[7，8]。生物鐘基因的異常表達可通過對下游時鐘控制基因的調(diào)控，導(dǎo)致腫瘤、內(nèi)分泌疾病、心血管疾病等疾病的發(fā)生[9，10]。

細胞周期基因亦可呈現(xiàn)晝夜節(jié)律，各種不同的細胞周期蛋白控制著細胞周期的各個階段。生物鐘基因的表達和特定的細胞周期階段具有相關(guān)性[11，12]。本研究發(fā)現(xiàn)，14個生物鐘基因在6種腹部惡性腫瘤癌組織中均低表達，表明生物鐘基因表達下調(diào)可能導(dǎo)致細胞周期基因下調(diào)，干擾細胞周期的不同階段，可造成惡性腫瘤細胞周期改變，使細胞呈現(xiàn)不受控制的異常增殖狀態(tài)。此外，生物鐘基因在惡性腫瘤組織中的表達異?？赏ㄟ^調(diào)控癌基因、抑癌基因、細胞周期蛋白、血管內(nèi)皮生長因子等時鐘控制基因參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、侵襲及腫瘤新生血管形成等生物學(xué)過程[4]。據(jù)報道，Per2基因低表達會引起p53、Bax和Timp-2基因表達下調(diào)，Ki-67、Mdm2、c-Myc和Bcl-2基因表達上調(diào)[7，13]。有研究還發(fā)現(xiàn)，Per2亦能抑制血管內(nèi)皮生長因子的轉(zhuǎn)錄[13]，從而抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞增殖。炎癥因子是腫瘤形成的重要介質(zhì)，而人體的免疫系統(tǒng)可以清除炎癥因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的屏障作用。有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子和血液中的B細胞、T細胞、NK細胞等免疫細胞介導(dǎo)的細胞和體液免疫均具有明顯的節(jié)律性。因此，當(dāng)生物鐘基因紊亂導(dǎo)致晝夜節(jié)律失衡后，炎癥反應(yīng)暴發(fā)，免疫系統(tǒng)失去穩(wěn)定性，導(dǎo)致腫瘤細胞不受控制和病情惡化[14，15]。

表1 14個生物鐘基因在腹部惡性腫瘤組織及鄰近正常組織中的表達比較(例份)

細胞內(nèi)的生物節(jié)律是生物鐘基因通過兩個重要的反饋回路實現(xiàn)的[16]。生物鐘基因存在兩個重要的反饋回路。①CLOCK與BMAL1形成CLOCK/BMAL1轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，隨后通過與Per1～3和Cry1、2基因啟動子上的E-box結(jié)合，激活其轉(zhuǎn)錄。編碼的Per1～3和Cry1、2蛋白會形成一個多聚體，由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，與CLOCK/BMAL1直接結(jié)合并抑制其活性，進而阻遏Per1～3和Cry1、2的轉(zhuǎn)錄，Per1～3和Cry1、2蛋白的降解會重新啟動CLOCK/BMAL1的轉(zhuǎn)錄，開始一個新的晝夜節(jié)律周期。②CLOCK與BMAL1形成的異二聚體激活孤兒核受體Rev-Erb基因的轉(zhuǎn)錄。Rev-Erb基因編碼蛋白可再與BMAL1啟動子相結(jié)合并阻遏其轉(zhuǎn)錄。除了轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，轉(zhuǎn)錄后基因的修飾也參與了晝夜節(jié)律蛋白的調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)，生物鐘基因的表達在鄰近正常組織中趨勢不一，一方面可能是因為下游生物鐘基因表達水平的差異，通過反饋回路反應(yīng)性地增加或降低上游生物鐘的表達水平；另一方面可能是因為本研究鄰近正常組織樣本量太少，存在誤差。

綜上所述，生物鐘基因異常表達在腹部惡性腫瘤組織中普遍存在。然而，導(dǎo)致這些惡性腫瘤組織生物鐘基因表達差異的具體機制及如何精確地促進惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展仍不清楚。生物節(jié)律紊亂可能導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生，惡性腫瘤的發(fā)生也可能影響生物鐘基因的表達。闡明生物鐘基因與惡性腫瘤的聯(lián)系，將有利于惡性腫瘤新治療策略的發(fā)展，并為臨床指導(dǎo)時辰治療、評估疾病預(yù)后等提供依據(jù)。將來，生物鐘基因有可能使時辰治療成為一種更為合理的腫瘤治療模式。