張金李，馮 翔

(1.河南省開封市中心醫(yī)院檢驗科 475000；2.河南省兒童醫(yī)院檢驗科,鄭州 450018)

近年來，病毒引起的新發(fā)傳染病逐漸增多，對人類影響也越來越大，迅速準確的病原體診斷是治療和防止暴發(fā)流行的最重要的步驟之一[1]。目前，病原體的診斷所用到的技術(shù)越來越多，基于不依賴序列擴增技術(shù)結(jié)合宏基因組的方法已成功用于檢測和發(fā)現(xiàn)新病毒，即使在病毒數(shù)量很低的情況下，融合以上技術(shù)優(yōu)勢的高通量測序技術(shù)具備檢測所有病毒的能力[2-3]。本文應用Ion torrent高通量測序平臺對兒科1例重癥肺炎患者進行病毒宏基因組分析，初步探討其在臨床病原體診斷中的應用，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 肺泡灌洗夜標本(BALF)來源于開封市中心醫(yī)院兒科1例重癥肺炎患兒，臨床診斷為右肺肺炎，實驗室診斷為肺炎支原體感染。給予紅霉素、哌拉西林鈉他唑巴坦、阿奇霉素抗感染治療，效果不明顯，臨床醫(yī)生懷疑其合并病毒感染。

1.2儀器與試劑 病毒DNA/RNA提取試劑盒購自MN公司；Ion torrent測序配套試劑購自Themo熱科學公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根公司；長鏈高保真PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase及Ex Taq PCR試劑購自于寶生物工程有限公司；腺病毒熒光定量試劑盒購自達安基因公司；所用聚合酶鏈反應(PCR)引物由上海英濰捷基公司合成；PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自Qiagen公司。

1.3方法

1.3.1肺泡灌洗夜標本病毒DNA/RNA提取 肺泡灌洗液標本處理：8 000 r/min，離心15 min，上清用于病毒基因組提取，DNA/RNA提?。喝∩锨?50 μL，試劑購于MN公司(NucleoSpin?RNA Virus 740956.10)，按照標準步驟進行。為了同時提取DNA病毒核酸，70 ℃水浴之前加入20 mg/mL蛋白酶K溶液20 μL。

1.3.2病毒DNA/RNA的隨機引物擴增 取2 μL核酸，加入1 μL 100 pmol/μL接頭引物FR26RV-N(5′-GCC GGA GCT CTG CAG ATA TCN NNN NN-3′)，75 ℃作用5 min后置冰浴2 min。按比例加入FastQuant RT試劑，42 ℃反應50 min，95 ℃ 反應2 min合成cDNA；加1 μL(2.5 U)DNA聚合酶Klenow片段，2 μL FR26RV-N(10 pmol)，2.5 μL 10×buffer，37 ℃反應60 min合成dsDNA，75 ℃滅活10 min。取上述反應液模板5 μL，加2 μL PrimeSTAR GXL DNA聚合酶，10 μL 5×PrimeSTAR?GXL緩沖液，4 μL dNTP混合物，4 μL 10 pmol/μL的擴增引物FR20RV(5′-GCC GGA GCT CTG CAG ATA TC-3′)，雙蒸水補充至50 μL，經(jīng)不依賴序列的單引物擴增：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴增產(chǎn)物純化后采用Qubit2.0進行產(chǎn)物定量。

1.3.3高通量測序 文庫構(gòu)建、文庫擴增以及測序按照試劑盒和儀器說明書進行。取100 ng純化之后的產(chǎn)物，BioRuptor超聲系統(tǒng)隨機打斷至200 bp，采用Ion XpressTMPlus DNA Fragment Library kit試劑盒連接接頭；采用2% E-gel選擇回收大小在330 bp的條帶并采用Qubit2.0進行文庫定量。油包水聚合酶鏈式反應(PCR)和磁珠顆粒(ISPS)富集采用Ion OneTouchTM200 Template Kit v2和Ion OneTouchTM進行油包水PCR；采用Ion Xpess template kit，MyOne streptavidin C1 beads和Ion OneTouchTMES進行模板富集。采用Ion PGMTMSequencing 200 kit及Ion 314TMChip進行測序，260個測序循環(huán)，標準壓縮氬氣進行驅(qū)動。

1.3.4腺病毒熒光定量PCR驗證 使用達安腺病毒熒光定量檢測試劑盒，進行腺病毒驗證。

2 結(jié) 果

2.1高通量測序初步結(jié)果 芯片有效區(qū)域達到82%，其中連接有文庫的有99%，除去36%多克隆、4%低質(zhì)量和1%測試片段，最終有效的文庫占59%，共591 593個讀取片段，測序平均讀長為159 bp，最長讀長為333 bp，產(chǎn)生的測序原始數(shù)據(jù)總量為93.6 Mb，Q20為73.46 Mb。

2.2本地Blast及相關(guān)病毒分析結(jié)果 Fastq格式數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)換為fasta格式，選擇一致性大于70%，E-value<10-5的序列作為有意義的序列，經(jīng)本地Blast進行序列分類，一共獲得591 593條讀長，其中人類序列206 469條，占41%；細菌序列76 794條(15.0%)；真菌序列1 415條(0.3%)，其中病毒序列3 545條，占(0.6%)；病毒病原體主要有腺病毒序列1 760條(49.6%)，淋巴囊腫疾病病毒序列1 422條(40.1%)；Taterapox病毒65條(1.8%)，智利巨型病毒37條(1.0%)，云杉卷蛾雕背姬蜂病毒33條(0.9%)，貓白血病病毒32條(0.9%)，網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生證病毒30條(0.8%)，RD-114逆轉(zhuǎn)錄病毒18條(0.5%)，其他病毒共148條(4.2%)。

2.3腺病毒熒光定量PCR結(jié)果 呼吸道病原體熒光定量PCR結(jié)果為腺病毒7型，CT值為27.04。提示患者腺病毒7型感染。

3 討 論

本研究通過采用不依賴序列的單引物擴增技術(shù)的病毒宏基因組方法結(jié)合Ion Torrent高通量測序平臺對兒科重癥肺炎患兒呼吸道肺泡灌洗液進行病毒病原體宏基因組分析，快速篩選出了標本中含有的腺病毒及其他病毒基因序列，整個試驗只需2～3 d就能完成，測序成本也低至幾千元，提示這種不依賴序列的病原體鑒定技術(shù)由于不需要預先知道病原體基因組信息，也不用專門針對病原體設計多對引物，特別適合于醫(yī)院、疾病預防控制中心等機構(gòu)在某種突發(fā)傳染病的早期采用這種技術(shù)手段進行病毒性病原體鑒定，這種技術(shù)已成功用于病毒的鑒定、病毒基因組測序、輸血制品病原體的篩選等[4]。

腺病毒7型是臨床常見的病原體類型，主要引起上呼吸道急性感染，是社區(qū)獲得性肺炎及重癥肺炎的重要病原體[5]，患者肺泡灌洗液標本中也發(fā)現(xiàn)其他病毒種類序列的存在，淋巴囊腫病毒-中國株是引起上百種淡、海水魚產(chǎn)生囊腫的主要病原體，暫無人感染病例的報道，其他如Taterapox病毒、智利巨型病毒、云杉卷蛾雕背姬蜂病毒等也暫時無人感染病例[6]。

本次測序數(shù)據(jù)中人類基因組序列所占比例較大，病毒序列只占很少一部分，與國內(nèi)研究相似[7]，分析原因可能因為肺泡灌洗液中含有大量的宿主細胞，標本提取前未經(jīng)使用過濾系統(tǒng)去除宿主細胞等體積較大的物質(zhì)，也未加入DNA酶和RNA酶去除標本提取前存在的裸DNA和RNA有關(guān)。另外也可能與標本中腺病毒濃度有關(guān)，標本熒光定量PCR結(jié)果顯示腺病毒CT值為27.04,腺病毒序列拼接基因組覆蓋度79%，測序品均深度8×。有研究者發(fā)現(xiàn)，如果標本中病毒粒子的濃度大于107個/μL，則較容易獲得相關(guān)病毒的全基因組序列及較高的測序深度[8-9]。相對于DNA病毒，高通量技術(shù)檢測RNA病毒相對容易[10]。有試驗證明，標本提取核酸之前依次進行高速離心、過濾和酶處理3步法處理能夠富集病毒粒子，提高測序數(shù)據(jù)中病毒序列所占的比例[11]。

測序過程一個重要的挑戰(zhàn)是數(shù)據(jù)分析，雖然有一些開放平臺給研究者使用，如MetaVir和Vipie可免費使用，但是分析過程及等待時間均較長。因此，各個實驗室及科研平臺應該建立適合自己的平臺，提高病原體檢測速度。