王晶晶,田晨光,張金盈,張繼佳,吳照科*

(1河南省人民醫(yī)院省直第一醫(yī)院高血壓科，鄭州 450003；2鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分秘科，鄭州 450014；3鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，鄭州 450052；4鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，鄭州 450014)

心力衰竭是指由于心臟的收縮功能和舒張功能發(fā)生障礙，不能將靜脈回心血量充分排出心臟，導(dǎo)致靜脈系統(tǒng)血液淤積，動(dòng)脈系統(tǒng)血液灌注不足，進(jìn)而引起心臟循環(huán)障礙癥候群[1]。心肌重塑涉及心肌細(xì)胞的自噬、凋亡、肥大、血管新生及細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)改變的多個(gè)病理生理過(guò)程[2-4]。與此同時(shí)，心力衰竭時(shí)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮性增高，多種內(nèi)源性的神經(jīng)內(nèi)分泌和細(xì)胞因子激活，其長(zhǎng)期慢性激活促進(jìn)了心肌重構(gòu)，加重了心肌損傷和心功能的惡化，進(jìn)而過(guò)度激活神經(jīng)內(nèi)分泌因子分泌，形成惡性循環(huán)，加劇了心力衰竭的進(jìn)展[5]。細(xì)胞自噬在心力衰竭中的重要性越來(lái)越受到重視，如擴(kuò)張型心肌病、心瓣膜病和缺血性心臟疾病所導(dǎo)致的心衰均能發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞自噬水平出現(xiàn)顯著降低，提示心肌自噬不足與心力衰竭的發(fā)病密切相關(guān)[6]。異丙腎上腺素是β受體激動(dòng)劑，利用異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的損傷可引起心肌細(xì)胞肥大甚至心肌重構(gòu)，同時(shí)也引起心肌能量代謝的紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，直接影響心臟功能[7-9]。

千層紙素A(oroxylin A，OA，圖1)又名千層紙黃素，木蝴蝶素，是常見(jiàn)的植物次生代謝產(chǎn)物，主要存在于木蝴蝶和黃芩中，屬于黃酮類(lèi)化合物[10-11]。OA具有廣泛的藥理活性，如改善脂肪肝[12]、抑制流感病毒復(fù)制[13]、舒張血管[14]、抗腫瘤[15]等功效。此外，OA還可通過(guò)激活PPARγ抑制NLRP3炎癥小體從而改善炎癥性腸病[16]。目前OA對(duì)心力衰竭是否具有改善作用尚不清楚，因此本研究擬考察OA對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心力衰竭的改善作用，并對(duì)作用機(jī)制進(jìn)行探討。

Figure1 Chemical structure of oroxylin A (OA)

1 材 料

1.1 藥品與試劑

千層紙素A(oroxylin A，OA,純度大于98%，江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司)；異丙腎上腺素(isoproterenol,ISO，百靈威科技有限公司)；美托洛爾(廣州楊葉生物科技有限公司)。

胎牛血清(美國(guó)BI公司)；雙抗、不含EDTA的胰酶(上海源培公司)；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒及DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；Western blot試劑及IP裂解液(碧云天公司)?？笰KT1抗體、抗磷酸化AKT1抗體、抗RPS6KB1 抗體、抗磷酸化RPS6KB1抗體、抗RPS6抗體以及抗磷酸化RPS6抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；抗LC3B抗體、抗p62抗體和抗Actin抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

CO2培養(yǎng)箱及低速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)；電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Nikon 公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；超純水儀(美國(guó)Millopore公司)。

1.3 動(dòng) 物

實(shí)驗(yàn)用清潔級(jí)SD大鼠，雄性，200～220 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)為SCXK(京)2016-0006，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，自由飲水，室溫20～25 ℃，濕度50%～60%，光照12 h明暗交替。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 大鼠心力衰竭模型的建立

大鼠先用異丙腎上腺素ISO(1 mg/(kg·d)，皮下注射，連續(xù)10 d)誘導(dǎo)心力衰竭模型[17]，行超聲心動(dòng)圖檢查后，心臟射血分?jǐn)?shù)超過(guò)45%的被排除，剩下的大鼠被隨機(jī)分為5組：模型組、美托洛爾組10 mg/(kg·d)、OA組25 mg/(kg·d)、50 mg/(kg·d)、100 mg/(kg·d)，每組8只大鼠，每天給藥1次，每次3 mL，灌胃給藥8周。正常對(duì)照組大鼠與ISO組大鼠給予同體積的CMC-Na溶液。

2.2 心臟功能指數(shù)測(cè)定

大鼠造模8周后，檢測(cè)大鼠血流動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，左室收縮末壓(LVESP)、左室舒張末壓(LVEDP)、等容收縮期左心室壓力上升最大速率(+dp/dtmax)和等容舒張期左心室壓力下降最大速率(-dp/dtmax)；并用彩超儀檢測(cè)大鼠心臟功能。大鼠取血后3 500 r/min離心15 min，小心吸取上清液后，存放于-80 ℃冰箱保存，用商品化試劑盒檢測(cè)血清中去甲腎上腺素、醛固酮、腦鈉肽、內(nèi)皮素-1和血管緊張素Ⅱ的水平。

2.3 蘇木精-伊紅染色和Masson染色

取大鼠心肌組織先用10%中性福爾馬林固定液固定，石蠟包埋并切片后，用蘇木精-伊紅染液和Masson進(jìn)行染色，在鏡下觀(guān)察并拍攝照片。

2.4 ISO體外誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組

出生1～3 d的正常SD大鼠的乳鼠，按文獻(xiàn)方法[18]提取原代心肌細(xì)胞。從正常SD大鼠乳鼠中取出心肌組織，先用膠原酶消化，再使用差速貼壁方法分離得到原代心肌細(xì)胞，種于24孔板，37 ℃培養(yǎng)48 h后，分為4組進(jìn)行不同預(yù)給藥：培養(yǎng)基對(duì)照組、ISO模型組、OA低劑量組(3 μmol/L)及OA高劑量組(10 μmol/L)。OA孵育細(xì)胞6 h后，ISO模型組、OA低劑量組及高劑量組分別用1 μmol/L ISO刺激30 min，然后收集細(xì)胞，免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞自噬通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。

2.5 細(xì)胞蛋白定量

先用PBS快速?zèng)_洗細(xì)胞2遍后；加入適量的裂解液(含蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑)，將細(xì)胞吹下，冰上靜置10 min，離心13 500 r/min，5 min，棄沉淀，取上清液待用。利用BCA法測(cè)定不同濃度BSA以及上清液的吸收度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)酶標(biāo)儀所示吸收度，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，讀取上清液中蛋白濃度。

2.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié) 果

3.1 OA顯著改善ISO誘導(dǎo)的大鼠心力衰竭模型中心臟功能障礙和心肌重構(gòu)

ISO可誘導(dǎo)大鼠發(fā)生實(shí)驗(yàn)性心臟功能障礙，如圖2所示，ISO造模8周后左室收縮末壓(LVESP)、等容收縮期左心室壓力上升最大速率(+dp/dtmax)和等容舒張期左心室壓力下降最大速率(-dp/dtmax)均明顯下降，而左室舒張末壓(LVEDP)和左心室指數(shù)(LVMI)明顯上調(diào)；在給予OA治療后顯著地逆轉(zhuǎn)了心臟功能障礙、心肌肥厚以及血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的改變。

Figure2 OA alleviates deranged cardiac parameters in rats with heart failure caused by isoproterenol

#P<0.05,##P<0.01vsnormal group;*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

根據(jù)超聲心動(dòng)圖分析數(shù)據(jù)，與正常大鼠相比，ISO造模后的大鼠心臟射血分?jǐn)?shù)顯著降低。而OA給藥組明顯改善了大鼠心力衰竭后的心臟射血分?jǐn)?shù)(圖3)。

Figure3 OA improves echocardiography parameters of the left ventricular in rats with heart failure caused by isoproterenol

##P<0.01vsnormal group;*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

此外，H&E和Masson染色還提示OA顯著緩解了受損心肌組織的病理改變?nèi)缧募》蚀?、心肌黏連形成、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、心肌纖維化等(圖4-A,4-B)。進(jìn)一步，OA改善心肌纖維化的效應(yīng)又在羥脯胺酸測(cè)定試驗(yàn)中得到證實(shí)(圖4-C)。本研究還利用電鏡對(duì)慢性心衰大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)改變進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，與正常組相比，心力衰竭模型組的主要損傷部位是線(xiàn)粒體和橫紋肌的形態(tài)，其中線(xiàn)粒體的內(nèi)、外膜破損，有部分脊受損且消失；橫紋肌呈不連續(xù)形態(tài)，Z帶較寬(圖4-D)。OA給藥組的線(xiàn)粒體形態(tài)和橫紋肌形態(tài)有明顯改善，且高劑量組改善效果最顯著，尤其是線(xiàn)粒體的形態(tài)良好，與正常組較為接近(圖4-A,TEM組)。以上結(jié)果提示OA顯著改善了ISO誘導(dǎo)的大鼠心力衰竭模型中的心臟功能障礙以及心肌重構(gòu)。

Figure4 OA ameliorates histopathological changes of the left ventricular in isoproterenol-induced rat heart failure model

#P<0.05,##P<0.01vsnormal group;*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

3.2 OA顯著下調(diào)ISO誘導(dǎo)的大鼠心力衰竭模型中神經(jīng)內(nèi)分泌因子的釋放

從圖5可以看出，OA劑量依賴(lài)性地抑制了ISO所致心力衰竭大鼠血清中去甲腎上腺素(NE)、醛固酮(ALD)、腦鈉肽(BNP)、內(nèi)皮素-1(ET-1)以及血管緊張素Ⅱ(ANG-II)等的水平。這些神經(jīng)內(nèi)分泌因子的下調(diào)對(duì)于OA改善心力衰竭大鼠心臟功能障礙以及心肌重塑起重要作用。

NE:Norepinephrine；ALD:Aldosterone；BNP:Brain natriuretic peptide；ET-1:Endothelin 1；ANG II:Angiotensin II

#P<0.05,##P<0.01vsnormal group;*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

3.3 OA促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬改善心力衰竭

為了考察自噬是否參與ISO誘導(dǎo)的大鼠心力衰竭模型，檢測(cè)了體內(nèi)心肌組織的自噬水平。LC3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中反映自噬狀態(tài)的蛋白，取大鼠的心肌組織，免疫沉淀法檢測(cè)LC3-I和LC3-II的表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，在OA治療組中，特別是在100 mg/kg的OA治療組中，LC3-II的表達(dá)明顯增加，LC3-II/LC3-I比值明顯上升(圖6-A,6-B)。此外，還發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白p62的表達(dá)水平在OA處理后顯著降低(圖6-A,6-B)。

為了進(jìn)一步證實(shí)OA誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬這一結(jié)果，采用新生大鼠心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，與正常組相比，ISO模型組心肌細(xì)胞的自噬水平顯著降低(圖6-C,6-D)。然而，OA預(yù)處理大大增加了LC3-I到LC3-II的轉(zhuǎn)換，且呈劑量依賴(lài)關(guān)系。此外，p62的表達(dá)在OA處理下也明顯的減少(圖6-C,6-D)。以上結(jié)果提示OA體外可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生自噬。綜合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OA可以在體內(nèi)外觸發(fā)心肌細(xì)胞自噬來(lái)改善ISO誘導(dǎo)的心力衰竭。

3.4 OA通過(guò)抑制AKT1-RPS6KB1信號(hào)促進(jìn)自噬

AKT1-核糖體蛋白S6激酶多肽1(RPS6KB1)信號(hào)通路在自噬調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。本研究用免疫沉淀法考察了心肌細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。OA顯著地抑制AKT1在Ser473和Thr308位點(diǎn)的磷酸化(圖7-A,7-B)。此外，OA也劑量依賴(lài)性地下調(diào)了p-RPS6KB1和p-RPS6的表達(dá)(圖7-C,7-D)。這些結(jié)果表明，OA通過(guò)下調(diào)AKT1-PRS6KB1信號(hào)通路促進(jìn)心肌細(xì)胞的自噬。

綜上所述，OA通過(guò)抑制AKT1-PRS6KB1信號(hào)通路促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬從而改善實(shí)驗(yàn)性大鼠心臟功能障礙。

4 討 論

心力衰竭是一種慢性進(jìn)展性疾病。在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中，心肌細(xì)胞自噬起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。心力衰竭時(shí)的“能量危機(jī)”可引發(fā)心肌細(xì)胞的自噬通路激活，自噬可降解異常蛋白質(zhì)及受損的細(xì)胞器，從而為細(xì)胞的自我更新提供必要的能量和物質(zhì)[19-20]。若這一過(guò)程中心肌細(xì)胞自噬出現(xiàn)障礙，則會(huì)加劇心力衰竭的進(jìn)展。通過(guò)外源性小分子化合物調(diào)節(jié)自噬的發(fā)生也已成為治療因自噬不足所致疾病的一種有效策略[21]。

前期研究表明，OA具有改善脂肪肝、抑制流感病毒復(fù)制、舒張血管等活性[12-14]，然而OA在心力衰竭中的作用還不清楚。因此，以ISO誘導(dǎo)的大鼠心力衰竭模型為研究對(duì)象，考察OA是否能改善心衰大鼠的癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，OA給藥組的心力衰竭大鼠紊亂的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)和心臟射血分?jǐn)?shù)得到顯著改善，受損心肌組織的病理改變明顯緩解，后期心力衰竭大鼠心肌纖維化的癥狀也得到顯著改善；OA還顯著下調(diào)ISO誘導(dǎo)的大鼠心衰模型中神經(jīng)內(nèi)分泌因子的釋放；進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，OA通過(guò)抑制AKT1-PRS6KB1信號(hào)通路促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬來(lái)改善實(shí)驗(yàn)性大鼠心臟功能障礙和心肌重塑。

#P<0.05,##P<0.01vsnormal group;*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

##P<0.01vsnormal group;*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

自噬是機(jī)體在生理和病理狀態(tài)下維持穩(wěn)態(tài)平衡的關(guān)鍵。因此，自噬水平的改變與惡性腫瘤、神經(jīng)退行性疾病以及心血管疾病等密切相關(guān)[22-24]。已有報(bào)道顯示，心肌自噬功能紊亂在心肌重塑和心力衰竭中起著至關(guān)重要的作用[25]。本研究結(jié)果提示，OA能改善心臟重構(gòu)和左心室功能障礙，但是否能調(diào)節(jié)心肌的自噬尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OA顯著增加了LC3-I到LC3-II的轉(zhuǎn)換，同時(shí)減少了自噬相關(guān)蛋白p62的表達(dá)，提示OA可誘導(dǎo)受損的心肌細(xì)胞自噬。據(jù)報(bào)道，AKT1-RPS6KB1信號(hào)通路在自噬的調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用[26]。本研究發(fā)現(xiàn)OA處理后p-RPS6KB1、p-RPS6以及p-AKT1均呈現(xiàn)劑量依賴(lài)的下調(diào)。這些結(jié)果提示OA促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬與抑制AKT1-RPS6KB1信號(hào)通路有關(guān)。然而OA是如何促進(jìn)受損心肌細(xì)胞的自噬還需要進(jìn)一步的研究。

總之，OA能夠顯著地改善ISO誘導(dǎo)的心力衰竭大鼠心臟的重構(gòu)以及左心室的功能障礙。OA改善心力衰竭的機(jī)制可能與抑制AKT1-RPS6KB1信號(hào)通路促進(jìn)損傷心肌細(xì)胞自噬有關(guān)。本研究為千層紙素A作為臨床上治療心力衰竭的候選藥物提供了理論依據(jù)。