(南召縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所, 河南 南召 474650)

1 疊氮溴化丙錠的介紹

疊氮溴化丙錠（PMA）是一種光敏反應(yīng)染料，它對(duì)DNA具有非常高的親和力。當(dāng)細(xì)胞膜處于不完整狀態(tài)或者細(xì)胞已經(jīng)死亡，細(xì)胞膜對(duì)外界的物質(zhì)的進(jìn)出就沒有了選擇性，PMA就可以順利進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與DNA進(jìn)行結(jié)合，在光照作用下發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。交聯(lián)后的DNA就不能作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，殘留在溶液中的未被結(jié)合的PMA在光照下與水分子形成羥胺化合物，從而阻止其與在提取過程中活菌產(chǎn)生的DNA結(jié)合，影響檢測(cè)結(jié)果。而對(duì)于活的細(xì)胞而言，細(xì)胞膜具有選擇性，PMA便不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。將PMA這種特性與熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行偶聯(lián)，便可以實(shí)現(xiàn)對(duì)活菌的檢測(cè)[1]。

2 影響活菌檢測(cè)的因素

2.1 采集的樣品

PMA偶聯(lián)熒光PCR技術(shù)對(duì)樣品的要求比較高。有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中的樣品，食品樣品和臨床上的病料中常常含有一些無機(jī)物質(zhì)，有機(jī)物質(zhì)。這些物質(zhì)的存在既可以降低PMA的有效濃度，也可以干擾PMA與核酸的交聯(lián)反應(yīng)。詳細(xì)的說，樣品中的無機(jī)物和有機(jī)物會(huì)造成樣品的濁度提高，樣品越渾濁，光的透過性就越差，越影響PMA與樣品在光照條件下的交聯(lián)反應(yīng)。為了避免和減少因樣品采集帶來的誤差，Luo等人在一項(xiàng)研究中提出，要嚴(yán)格規(guī)范濁度的閾值，這樣對(duì)每一份樣品檢測(cè)具有更重要的意義和參考價(jià)值。有研究表明，當(dāng)樣品的濁度達(dá)到10個(gè)散射濁度單位的時(shí)候，樣品的濁度對(duì)于PMA交聯(lián)DNA是沒有影響的。當(dāng)樣品的濁度高于10個(gè)散射濁度時(shí)，樣品的濁度對(duì)于PMA交聯(lián)DNA具有非常大的影響。

2.2 PMA與DNA作用階段

PMA與DNA作用階段主要是指PMA進(jìn)入細(xì)胞膜受損傷的過程和PMA結(jié)合DNA的過程。PMA是一種對(duì)光較為敏感的染料，即便在普通光源下，也能降低PMA的有效濃度。因此，在PMA與細(xì)胞核DNA作用的過程中要避光。在這個(gè)過程中，PMA的濃度、PMA與核酸的作用時(shí)間，溫度等都會(huì)影響最終的檢測(cè)結(jié)果。有些學(xué)者在參考別的研究者活菌檢測(cè)技術(shù)時(shí)，設(shè)置了同樣的溫度、濃度和時(shí)間，但是結(jié)果卻不甚理想。其主要原因是樣品不同，最佳的PMA的濃度和作用時(shí)間也會(huì)有很大的差異。如較低濃度時(shí)，PMA是不能夠完全結(jié)合掉所有的死菌DNA，那么部分沒有結(jié)合的死菌的DNA便可以作為模板被擴(kuò)增出來，從而造成活菌檢測(cè)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。如果PMA的濃度過高，PMA也可以滲入到活的細(xì)胞中，將部分活的細(xì)胞DNA結(jié)合掉，造成檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。因此，無論是做哪一項(xiàng)活菌檢測(cè)，PMA的濃度和作用時(shí)間等參數(shù)要先優(yōu)化，后使用。PMA進(jìn)入細(xì)胞的效率和有效結(jié)合DNA的效率還與溫度有關(guān)。有研究表明。在室溫的條件下，PMA結(jié)合DNA的效率最高。另外，PMA與細(xì)胞的作用時(shí)間也要考慮到位。作用時(shí)間過長，PMA也能夠滲透到活細(xì)胞中，造成結(jié)果的不準(zhǔn)確[2]。

2.3 PMA與DNA的交聯(lián)

在光照條件下，PMA與DNA能夠發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。但是有效的交聯(lián)反應(yīng)仍然依賴于光源和光處理時(shí)間的長短。光源的光譜不同時(shí)，PMA的激活效果也存在很大的差異。最為合適的光源是光的波長能夠有效激發(fā)PMA分解。研究表明，500～750w的金屬鹵素?zé)羰亲罴训墓庠础９庹諘r(shí)，樣品要放在光下20～30cm處，保障PMA與樣品中的DNA有效交聯(lián)。但是值得注意的是，在較高功率的鹵素?zé)粽丈湎?，部分活菌?huì)嚴(yán)重受熱死亡。為了避免這種現(xiàn)象的發(fā)生，Vesper等人首次將發(fā)光二極管代替鹵素?zé)?，這樣既保障了激發(fā)PMA的最佳發(fā)射波長，又避免了熱量造成的活菌的死亡。光照時(shí)間是整個(gè)處理中不可小覷的環(huán)節(jié)。樣品，實(shí)驗(yàn)條件的不同，光照時(shí)間也會(huì)有很大的差異。一般情況下，光照時(shí)間控制在20min以內(nèi)。光照時(shí)間過短，PMA與DNA的交聯(lián)反應(yīng)不徹底，同時(shí)，殘留在液體中的游離的PMA也不能完全失活。較長時(shí)間的光照時(shí)間又會(huì)引起活菌的死亡。因此，需要選擇恰當(dāng)?shù)墓庹諘r(shí)間。

3 目標(biāo)基因的選擇

除了以上信息需要考慮外，目標(biāo)基因的位置和片段的大小也會(huì)影響最后的檢測(cè)結(jié)果。Soejima在用PMA偶聯(lián)PCR技術(shù)檢測(cè)單增李斯特菌的過程中發(fā)現(xiàn)，片段越長，PMA對(duì)熒光PCR的抑制效果越明顯。還有學(xué)者認(rèn)為，對(duì)于同一種細(xì)菌檢測(cè)時(shí)，運(yùn)用不同的片段，檢測(cè)得到的結(jié)果差異非常顯著[3]。

4 PMA偶聯(lián)熒光PCR的應(yīng)用

Zhu等人用PMA-qPCR檢測(cè)樣品中的副溶血性弧菌的活菌量時(shí)發(fā)現(xiàn)，PMA的最佳濃度時(shí)8ug/mL，并且當(dāng)細(xì)菌的濁度低于10個(gè)NTU時(shí)，OD值低于0.8時(shí)，PMA能夠有效抑制死菌的擴(kuò)增。黃韻等人運(yùn)用PMA-qPCR檢測(cè)技術(shù)成功檢測(cè)出處于VBNC狀態(tài)下的單增李斯特菌活菌。Li等人在用PMA-qPCR檢測(cè)沙門氏菌活菌檢測(cè)，并對(duì)基因片段的長度進(jìn)行優(yōu)化和選擇，結(jié)果表明，PMA對(duì)死菌DNA的抑制作用與核酸片段長度有關(guān)，核酸片段長度越長，PMA對(duì)死菌的抑制作用越好。當(dāng)長度高于260bp時(shí)，檢測(cè)的靈敏性會(huì)突然下降。長度低于130bp時(shí)，則無法有效抑制死菌DNA的擴(kuò)增。

[1]陳麗芬.兩種實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌的比較和分析[J].醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制,2016(05)：581-582+58.

[2]吳碧文.金黃色葡萄球菌在不同食品中的檢出率分析[J].福建分析測(cè)試,2015(02)：51-54.

[3]張崇娥.不同食品中金黃色葡萄球菌的檢出分析[J].求醫(yī)問藥(下半月),2012(07)：9-10.