高 芬， 岳換弟， 秦雪梅， 雷振宏， 王夢亮

(1.山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所，山西 太原 030006; 2.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006; 3.山西振東道地藥材開發(fā)有限公司，山西 長治 047100 )

鐮刀菌(Fusarium)屬于半知菌類(Fungi Imperfecti)、叢梗孢目(Moniliales)、瘤座孢科(Tuberculariaceae)，該屬真菌寄主范圍廣，可侵染大多數(shù)糧食和經(jīng)濟(jì)植物。目前，國內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道被鐮刀菌嚴(yán)重危害的植物既有小麥、玉米、水稻等糧食作物，也有番茄、豆類、黃瓜等蔬菜作物和哈密瓜、西瓜、香蕉、甘蔗等水果植物，以及丹參、黃芪、蘆薈等藥用植物[1-2]。鐮刀菌引發(fā)的病害嚴(yán)重威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和安全。

鐮刀菌的生化致病機(jī)制非常復(fù)雜，有多種細(xì)胞壁降解酶(Cell wall degrading enzyme, CWDE) 和毒素參與。CWDE主要是降解寄主植物的細(xì)胞壁，從而利于病原真菌的侵入、定殖與擴(kuò)展[3]。本文主要從鐮刀菌產(chǎn)生CWDE的種類、作用機(jī)制、影響因素及其與植物抗菌次生代謝物之間的關(guān)系等方面來闡釋其研究進(jìn)展，以期為深入研究其侵染致病機(jī)制，進(jìn)而尋找新的病害控制措施提供參考。

1 鐮刀菌分泌的細(xì)胞壁降解酶的種類和作用機(jī)制

植物細(xì)胞壁主要成分為纖維素、半纖維素、果膠及木質(zhì)素等。在病原菌侵染寄主植物致病的過程中，植物細(xì)胞壁復(fù)雜且有規(guī)則的結(jié)構(gòu)能對病原菌的侵害構(gòu)成屏障；病原菌則可通過分泌一系列細(xì)胞壁降解酶，突破寄主植物的細(xì)胞壁，進(jìn)而侵染植物使其發(fā)病。目前研究結(jié)果表明，鐮刀菌分泌的細(xì)胞壁降解酶主要包括果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶和磷脂酶等[4]。

1.1 果膠酶

果膠酶是能夠分解果膠物質(zhì)的多種酶的總稱。果膠酶分為果膠水解酶、果膠裂解酶(PNL或PML)、果膠酸酯裂解酶(PL)、果膠甲基酯酶(PE)和原果膠酶等。其中，果膠水解酶又可分為多聚半乳糖醛酸酶(PG)和聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)等。多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PMTE)是一種果膠裂解酶，果膠甲基反式消除酶(PGTE)則是一種果膠酸酯裂解酶[3-4]。不同種類的果膠酶在病菌侵染過程中作用不同。PG主要水解細(xì)胞壁中的多聚半乳糖醛酸，生成低聚半乳糖醛酸和半乳糖醛酸；PMG水解高度酯化的果膠酸酯 α-1,4糖苷鍵；PGTE優(yōu)先裂解果膠酸分子中的 α-1,4糖苷鍵；PMTE降解果膠或甲基酯化的多聚半乳糖醛酸；PE則能將果膠或果膠脂酸的甲氧基脫掉產(chǎn)生果膠酸[4]。

果膠酶是鐮刀菌最重要的毒力因子之一，其活性大小決定著植物的發(fā)病程度[5]。目前，許多鐮刀菌分泌的果膠酶得到了較為深入的研究。蓮腐敗病菌(F.oxyporumf. sp.Nelumbicola)體外培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生的PG活性明顯高于PMG、PGTE和PMTE[6]；馬鈴薯干腐病菌(F.sulphureumSchlechlendahl)侵染馬鈴薯后產(chǎn)生的PG、PMG、PGTE、PMTE、PE和PML等6種果膠酶中，PG的活性也明顯高于其他酶[7]。不同的鐮刀菌屬真菌，甚至同一種鐮刀菌屬真菌的不同小種在活體內(nèi)外產(chǎn)生果膠酶的種類和活性有明顯差異。Shukla等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Pigeon pea枯萎病菌(F.udum和F.oxysporumf.sp.ciceri)活體外產(chǎn)生的PG和PMG活性隨時(shí)間的延長而增加，且F.udum產(chǎn)生的PG和PMG活性及該菌株的致病力均明顯高于F.oxysporumf.sp.ciceri。董章勇等[9]比較香蕉枯萎病菌 (F.oxysporumf. sp.cubense，F(xiàn)OC) 1號(hào)生理小種(FOC1)和4號(hào)生理小種(FOC 4)所產(chǎn)生的4 種果膠酶(PG、PMG、PGTE、PMTE) 后發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)時(shí)2個(gè)生理小種分泌的PMG、PGTE和PMTE沒有差異，但FOC 4比FOC 1多一種PG；在寄主體內(nèi)時(shí)，F(xiàn)OC 4可產(chǎn)生PG、PMG和PMTE，而FOC1僅產(chǎn)生PGTE和PMTE。同時(shí)，進(jìn)一步在生理小種FOC1和FOC4中檢測到了編碼外切多聚半乳糖醛酸酶(exo-PG)的基因FOC1-pgc3和FOC4-pgc3，且FOC1產(chǎn)生的PGC3酶活性及其對香蕉根部組織的降解能力均強(qiáng)于FOC4[10]。Mohsen等[11]在F.oxysporum和F.sacchari中檢測到編碼exo-PG的基因pgx1。Liu等[12]則檢測到棉花枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.vasinfectum)編碼endo-PG的基因FOVPG1，并推測PG可能在鐮刀菌侵染寄主使其致病的過程中起關(guān)鍵作用。另有研究結(jié)果表明，番茄枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.lycopersici)侵染番茄后，編碼 endo-PG(pg1、pg5) 和exo-PG(pgx4、pgx6) 的基因表達(dá)量顯著增加，但單個(gè)基因pg1或pgx6的靶向缺失不影響該菌的感染能力，2個(gè)基因同時(shí)缺失則導(dǎo)致其毒力嚴(yán)重降低[13]。

1.2 纖維素酶

纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，在細(xì)胞壁物質(zhì)的軟化和分解中起著非常重要的作用，主要包括內(nèi)切1，4-β-D葡聚糖酶(Cx/CBH)、外切1，4-β-D葡聚糖酶(C1/EG)和β-葡萄糖苷酶(βG) 3類。

纖維素酶活性也影響著鐮刀菌的致病力[5]。纖維素酶中βG和Cx兩類酶的研究較為常見和深入。鐮刀菌不同致病力菌株侵染同一寄主時(shí)，βG活性存在明顯差異，例如引起瓜類枯萎病的F.oxysporum強(qiáng)致病力菌株βG活性明顯高于致病力較弱或無致病力菌株[14]。然而，βG并不是決定鐮刀菌致病力大小的唯一因素。在馬鈴薯干腐病菌(F.sulphureum)的侵染過程中，Cx對馬鈴薯組織細(xì)胞壁的降解作用先于βG進(jìn)行，且活性明顯高于βG[7]。Huang等[15]發(fā)現(xiàn)Fusariumspp. 與其他真菌相比，能產(chǎn)生更多的βG，并在紅薯腐爛病菌(F.commune)中檢測到147個(gè)編碼βG的基因，與這些基因相關(guān)的βG主要為GH3、GH5、GH6、GH7、GH9、GH10、GH11、GH45等。

1.3 半纖維素酶

半纖維素是多糖聚合體的復(fù)雜混合物，其降解需要多種酶的參與，主要包括木聚糖酶(Xylanase)、半乳聚糖酶(Galactanase)、葡聚糖酶(Glucanase)、阿拉伯聚糖酶(Arabinanase)、甘露聚糖酶(Mannanase)等。其中，木聚糖酶是將木聚糖降解為寡聚木糖或木糖的一類復(fù)合酶系。木聚糖酶在鐮刀菌侵染禾本科植物過程中的作用是近年來的研究熱點(diǎn)。Bakri等[16]對引起敘利亞地區(qū)小麥赤霉病的3種致病力不同的鐮刀菌F.culmorum、F.solani和F.verticillioides在活體外產(chǎn)生木聚糖酶的能力進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)F.solani產(chǎn)木聚糖酶的活性明顯高于其他2種菌。而Khaledi等[17]發(fā)現(xiàn)，伊朗地區(qū)小麥赤霉病菌F.graminearum、F.culmorum、F.proliferatum、F.subglutinans、F.meridionaie、F.asiaticum在侵染小麥的過程中，均能產(chǎn)生木聚糖酶，其中F.graminearum產(chǎn)生的木聚糖酶活性最高。Sella 等[18-19]進(jìn)一步在小麥赤霉病菌F.graminearum中檢測到了FG03624、FGSG06445、FGSG11258、FGSG11304和FGSG11487等編碼木聚糖酶的基因，并發(fā)現(xiàn)F.graminearum中的Xyr1基因可調(diào)節(jié)木聚糖酶基因的表達(dá)，敲除Xyr1基因可大大降低其在體外和感染小麥穗期間木聚糖酶編碼基因的表達(dá)量，但是毒力卻并未因此減弱。遺傳冗余或木聚糖酶多型性的存在可能是病原菌在木聚糖酶基因被敲除后仍保持致病性的主要原因[20]。

1.4 其他酶類

除上述幾種主要的細(xì)胞壁降解酶外，蛋白酶、淀粉酶和磷脂酶等也在細(xì)胞壁降解中發(fā)揮著重要作用。例如，蛋白酶可降解植物細(xì)胞壁和膜內(nèi)的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞相互分離，組織變軟；淀粉酶降解植物體內(nèi)的淀粉，磷脂酶則主要降解脂類物質(zhì)[4]。

2 細(xì)胞壁降解酶與鐮刀菌致病性的關(guān)系

目前，細(xì)胞壁降解酶編碼基因的靶向敲除已經(jīng)在各種植物病原真菌中進(jìn)行。除少數(shù)情況外，植物鐮刀菌中單個(gè)細(xì)胞壁降解酶基因的缺失對毒力沒有重大影響[13,19]，原因在于鐮刀菌可能會(huì)通過調(diào)節(jié)其他細(xì)胞壁降解酶的表達(dá)來彌補(bǔ)這個(gè)基因缺陷；但若同時(shí)敲除2個(gè)或多個(gè)編碼CWDE的基因，突變株的致病力則會(huì)顯著降低[13,21]。例如，Paccanaro等[21]發(fā)現(xiàn)小麥赤霉病菌(F.graminearum)中Pg1和xyr1分別是編碼PG和Xyl的基因，單個(gè)敲除Pg1或xyr1基因后，各酶活性均明顯降低，但該菌株對于小麥的致病力卻未減弱，若將2個(gè)基因同時(shí)敲除則導(dǎo)致F.graminearum的毒力明顯降低。

另有研究結(jié)果表明，如果敲除掉調(diào)控細(xì)胞壁降解酶的某一個(gè)上游基因，突變株的致病力也會(huì)變?nèi)鮗22]。例如SNFI基因表達(dá)的SNIF蛋白激酶可以解除阻遏鐮刀菌細(xì)胞壁降解酶基因表達(dá)的碳分解代謝現(xiàn)象，當(dāng)把大豆根腐病菌(F.virguliforme)中的SNFI基因敲除后，突變體對特定碳源無法充分利用，一些細(xì)胞壁降解酶基因的表達(dá)量降低，同時(shí)對大豆的致病力也相應(yīng)變?nèi)鮗23]。除此之外，Jonkers等[24]還發(fā)現(xiàn)番茄枯萎病菌(F.oxysporumf. sp.lycopersici)中編碼F-box蛋白的基因frpl定點(diǎn)突變后，突變體中編碼果膠酶的PL1、PG1、PG2基因和編碼木聚糖酶的XYL2、XYL5基因的表達(dá)降低，致使其不能在植物根部有效定殖和侵入。

3 細(xì)胞壁降解酶之間的協(xié)同作用

不同的細(xì)胞壁降解酶在病原菌侵染和擴(kuò)展致病的不同時(shí)期所起的作用不同，且具有順序性和協(xié)同性[4]。在毛喉鞘蕊花根腐病菌(F.solani)[25]、小麥根腐病菌(F.culmorum)[26]中，2種菌產(chǎn)生的果膠酶PG先于纖維素酶Cx和木聚糖酶，且在侵染前期，寄主植物細(xì)胞壁中果膠降解的程度明顯大于纖維素和木聚糖。小麥赤霉病菌(F.graminearum)產(chǎn)生的PG可能在初期軟化宿主組織上起作用，木聚糖酶則涉及隨后真菌在木質(zhì)化的植物組織中的增殖[27]。在F.graminearum侵染小麥的過程中，PE主要在感染初期和中期促進(jìn)真菌在小麥穗中定殖，且對于高甲基酯化果膠，PE促進(jìn)PG活性的增加[28]。由此可見，在鐮刀菌侵染植物的過程中，果膠酶先行降解細(xì)胞壁中的果膠物質(zhì)，纖維素酶和半纖維素酶隨后降解纖維素類物質(zhì)，各種酶協(xié)同作用，使得鐮刀菌高效感染植物，完成侵染全過程。

4 影響鐮刀菌細(xì)胞壁降解酶活性的相關(guān)因素

在鐮刀菌體外誘導(dǎo)產(chǎn)酶及侵染寄主的過程中，細(xì)胞壁降解酶的產(chǎn)生不僅與其上游一系列基因的表達(dá)量、調(diào)控序列等因素有關(guān)，而且菌株致病力的強(qiáng)弱、寄主植物的感/抗病性、侵染時(shí)期、環(huán)境因子等，均會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶種類及其活性的不同。

4.1 菌株致病力和侵染時(shí)期對細(xì)胞壁降解酶活性的影響

鐮刀菌細(xì)胞壁降解酶的活性與菌株的致病性密切相關(guān)。Khaledi等[17]發(fā)現(xiàn)，混合侵染小麥引起赤霉病的多種鐮刀菌均能產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶，但F.graminearum強(qiáng)致病力菌株(FH1和FH8)產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性水平明顯高于弱致病力菌株(FH11和FH19)、及其他致病鐮刀菌F.proliferatum、F.culmorum、F.subglutinans、F.meridionale和F.asiaticum。

侵染時(shí)期的不同也會(huì)影響細(xì)胞壁降解酶活性。番茄枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.lycopersici)的木聚糖酶基因xyl5和xyl2的表達(dá)受特定時(shí)期的影響，xyl5只在侵染初期表達(dá)，xyl2在侵染末期表達(dá)，而xyl3和xyl4則在整個(gè)侵染病程中都有表達(dá)[20]。

4.2 寄主植物感/抗病性對細(xì)胞壁降解酶活性的影響

寄主植物品種的抗性對鐮刀菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶的活性和其基因表達(dá)量有一定影響。例如棉花枯萎病菌(F.oxysporumf. sp.vasinfectum)產(chǎn)生的PG對棉花幼苗的降解能力及其在寄主體內(nèi)的基因表達(dá)量與棉花對枯萎病的抗病性有關(guān)。在侵染前期，感病品種中果膠酶FOVPG1基因的表達(dá)量高于抗病品種，感病品種中棉花幼苗葉片的壞死癥狀也強(qiáng)于抗病品種[12]。Qin等[29]發(fā)現(xiàn)，香蕉枯萎病菌(F.oxysporumf. sp.cubenseFoc)在含不同碳源(葡萄糖、果膠和宿主細(xì)胞壁)的培養(yǎng)基上生長時(shí)，受宿主細(xì)胞壁誘導(dǎo)的基因表達(dá)譜與果膠或葡萄糖為碳源時(shí)誘導(dǎo)的基因表達(dá)譜明顯不同，這可能是由于宿主細(xì)胞壁由不同類型的多糖(纖維素、半纖維素和果膠)組成，使得被誘導(dǎo)表達(dá)的基因數(shù)量明顯高于其他2種碳源。由此推測，抗性品種和感病品種在細(xì)胞壁成分、含量與分布特征上的不同，可能影響鐮刀菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶的能力，并使其在不同的抗性品種上呈現(xiàn)出各異的侵染致病性。

4.3 環(huán)境因子對細(xì)胞壁降解酶活性的影響

鐮刀菌細(xì)胞壁降解酶的種類和活性變化受多種環(huán)境因素的調(diào)節(jié)。例如，F(xiàn).oxysporumURM 7401在酸性、中性和堿性等不同pH值的培養(yǎng)基中生長，產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶的活性變化不相同，且在中性和堿性條件下酶的代謝增加[30]。β-葡萄糖苷酶則在酸性條件下活性最大[31]。不同碳、氮源的種類及其濃度也會(huì)影響酶活性。在多種碳源同時(shí)存在時(shí)，β-葡萄糖苷酶活性明顯高于單一碳源，該酶活性隨碳源濃度的增加而逐漸增大；在無機(jī)氮源中β-葡萄糖苷酶活性明顯高于有機(jī)碳源。可見，不同誘導(dǎo)物對鐮刀菌合成細(xì)胞壁降解酶的誘導(dǎo)能力不同。產(chǎn)酶培養(yǎng)基的pH值及碳源和氮源的濃度等都會(huì)影響細(xì)胞壁降解酶活性。

5 植物抗菌次生代謝物對細(xì)胞壁降解酶活性的影響

鐮刀菌侵染寄主的過程中，細(xì)胞壁降解酶活性的變化可以反映不同鐮刀菌的致病能力。植物產(chǎn)生的抗菌次生代謝物，如酚類、異黃酮類、萜類等植保素等，則可通過抑制細(xì)胞壁降解酶的活性，抵抗鐮刀菌的侵染，可作為植物抗病性的指標(biāo)之一。

在植物界中分布最廣泛的次生代謝產(chǎn)物為酚類化合物[32]。酚類物質(zhì)作為植物體內(nèi)苯丙烷代謝的產(chǎn)物，與植物的抗病性有關(guān)，對病原真菌具有抑制作用[33]。例如香豆素不僅能抑制瓜類枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.niveum)菌絲體生長，而且還可抑制其纖維素酶和蛋白酶活性的增加[34]。Mohamed等[35]也發(fā)現(xiàn)，從Pulicariaincisa中提取到的酚酸和多酚類化合物，可抑制引起其枯萎病的F.oxysporum分泌的果膠酶、纖維素酶和蛋白酶的活性。

研究發(fā)現(xiàn)，酚類化合物如琥珀酸、單寧酸、阿魏酸和鄰苯二甲酸等，對細(xì)胞壁降解酶的作用具有不同的濃度效應(yīng)。琥珀酸和單寧酸在較低濃度時(shí)會(huì)增加西瓜枯萎病菌(F.oxysporumf. sp.niveum)產(chǎn)生的PG、Cx和蛋白酶活性，在較高濃度時(shí)則會(huì)顯著抑制這3種細(xì)胞壁降解酶的活性[36-37]。阿魏酸在不同濃度下對蛋白酶活性的影響與上述2種酚類物質(zhì)基本一致，對PG和Cx活性的影響卻正好相反。鄰苯二甲酸對PG、Cx和蛋白酶活性的影響則與琥珀酸和單寧酸的影響完全相反[38-39]。酚類化合物對淀粉酶活性的影響不明顯。

6 展 望

目前，雖然在各種鐮刀菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶的種類、致病機(jī)理、編碼基因等方面已經(jīng)取得了很大的研究進(jìn)展，但大都是針對單個(gè)酶的作用機(jī)制，處于單個(gè)基因功能的研究水平，至于各類細(xì)胞壁降解酶之間的協(xié)同作用、鐮刀菌細(xì)胞壁降解酶的整體基因調(diào)控機(jī)制等還有待繼續(xù)拓展研究。因此，在現(xiàn)有基因組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，利用RNA干擾、基因敲除和基因誘捕等新技術(shù)去發(fā)現(xiàn)新的相關(guān)基因的功能，闡釋基因調(diào)控的整體性，不僅有助于明確細(xì)胞壁降解酶在鐮刀菌致病過程中的作用和機(jī)制，也能為防治鐮刀菌類病害提供新的思路。

除細(xì)胞壁降解酶外，毒素也是鐮刀菌主要的致病因子。毒素和細(xì)胞壁降解酶在侵染致病過程中，哪一種為主要的致病因子，各種因子間如何協(xié)調(diào)作用，還有待進(jìn)一步研究明確。

鐮刀菌侵染過程中，寄主植物會(huì)產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物來抑制細(xì)胞壁降解酶的活性。這些產(chǎn)物不僅可直接抑制鐮刀菌生長侵入，而且是植物防御系統(tǒng)激活的指示因子，可作為植物的抗病性指標(biāo)。因此，從細(xì)胞壁降解酶的角度切入，尋找直接體現(xiàn)植物抵御鐮刀菌侵染的抗病相關(guān)生物指標(biāo)，對植物抗病育種和研究防病新策略具有重要意義。