單淑玲，龐勝群，郭曉珊，張國儒

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系/特色果蔬生理與種質(zhì)資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000)

0 引 言

【研究意義】番茄(LycopersiconesculentumMill.)是茄科番茄屬一年生或多年生草本植物，根據(jù)其用途分為加工番茄和鮮食番茄兩類。世界第一大番茄制品出口國是中國，美國加州、中國新疆與地中海并列為世界三大番茄醬產(chǎn)區(qū)[1]。番茄屬于自花授粉植物，番茄花由花梗、萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊組成，兩性花，聚傘花序，小果型品種多為總狀花序。影響單倍體育種成敗的關(guān)鍵因素之一是小孢子所處的發(fā)育時(shí)期[2]，研究小孢子發(fā)育時(shí)期與花器形態(tài)的相關(guān)性對單倍體育種有非常重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】對園藝植物中紅棗[3]、辣椒[4]、青花菜[5]、火龍果[6]、蘿卜[7]和甘藍(lán)[8]等小孢子細(xì)胞學(xué)與花器形態(tài)相關(guān)性研究已有報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，加工番茄常采用的育種方法為雜交育種，雜交育種獲得新品種(系)的周期較長。常見縮短育種周期，快速獲得植物新品種(系)的有效方法是植物單倍體育種。植物單倍體育種以花藥作為外植體利用花藥離體培養(yǎng)或游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)將花藥培養(yǎng)成單倍體植株，將單倍體植株加倍成純合二倍體的育種方法。研究小孢子發(fā)育時(shí)期及花器官形態(tài)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以加工番茄3個(gè)雜交種為材料，研究小孢子不同發(fā)育時(shí)期的花器形態(tài)與細(xì)胞學(xué)形態(tài)。確定小孢子不同發(fā)育時(shí)期的花器官形態(tài)，為加工番茄花藥培養(yǎng)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

以加工番茄的3個(gè)雜交品種(P1×20040805、20040805×鉆石和P3×20040805文中分別用字母C1,C2和C3代替)為材料，試驗(yàn)材料由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系蔬菜課題組提供。2017年8月將番茄種子催芽(溫湯浸種)后播種于50穴盤中，基質(zhì)為草炭和蛭石按體積比為1∶1進(jìn)行配置。待幼苗第四片真葉完全展開大概為35～40 d時(shí)，選取生長狀態(tài)一致的番茄幼苗定植于石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站溫室。正常田間管理至番茄植株盛花期開始采樣。

1.2 方 法

1.2.1 花蕾和花藥形態(tài)觀察與測量

于晴天08:00～10:00(采蕾環(huán)境溫度范圍為15～18℃)，采摘加工番茄健壯植株上的花蕾裝入自封袋內(nèi)做好標(biāo)記并放入冰盒內(nèi)快速帶回實(shí)驗(yàn)室。將采摘的花蕾隨機(jī)抽取并用游標(biāo)卡尺測量花蕾長度,每個(gè)品種按照花蕾長度,分為六個(gè)長度區(qū)間等級(3.00～3.99 mm；4.00～4.99 mm；5.00～5.99 mm；6.00～6.99 mm；7.00～7.99 mm和8.00及8.00 mm以上)，然后在解剖鏡下用鑷子剝?nèi)ポ嗥⒒ò?，取出花藥，觀察其顏色和形態(tài)特征。

1.2.2 花蕾細(xì)胞學(xué)觀察

將采摘好的花藥先用卡諾固定液(無水乙醇和冰醋酸體積比為3∶1)進(jìn)行處理，在室溫下固定24 h后，取出花蕾放入小燒杯，用蒸餾水沖洗2～3次，置于70%乙醇中，放在4℃冰箱中備用。鏡檢時(shí)將處理好的花蕾，用鑷子剝?nèi)ポ嗥?、花瓣，取出花藥。先滴一滴醋酸洋紅染液在載玻片上，然后取2枚花藥放在染液上用鑷子擠碎花藥，并將多余的花藥壁等雜質(zhì)夾出來。蓋上蓋玻片，將多余的醋酸洋紅染液用濾紙吸出。在數(shù)碼熒光倒置顯微鏡(Axio Observer.A1)下觀察，每個(gè)長度等級在顯微鏡下觀察100個(gè)不同視野，記錄每個(gè)視野中花粉細(xì)胞總數(shù)及單核靠邊期個(gè)數(shù)，并拍攝小孢子不同發(fā)育時(shí)期的照片。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用用SPSS 18.0軟件進(jìn)行處理，圖片采用IMAGE J軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 小孢子發(fā)育時(shí)期花器形態(tài)學(xué)特征

三個(gè)加工番茄品種均為聚傘花序，在種植過程中觀察發(fā)現(xiàn)，C1和C3始花期一致，而C2始花期較前者晚3 d，但不同品種加工番茄小孢子各發(fā)育時(shí)期對應(yīng)花器官外部形態(tài)特征基本相同。研究表明，花蕾和花藥發(fā)育進(jìn)程在花蕾大小，萼片顏色及花蕾閉合程度，花藥在顏色方面及剝離程度的變化?；ɡ匍L度在3.00～4.99 mm時(shí)花蕾較小、閉合嚴(yán)密、萼片呈綠色；花藥為綠色難剝離；花蕾長度在5.00～6.99 mm時(shí)花蕾膨大、微微張開、萼片黃綠色；花藥為黃綠色易剝離 ；花蕾長度在7.00～8.00 mm以上時(shí)花蕾明顯膨大、張開、萼片黃色，花藥為黃色易剝離。圖1

2.2 小孢子發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞學(xué)特征

研究表明，四分體時(shí)期是小孢子母細(xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂產(chǎn)生，小孢子母細(xì)胞被一層厚厚的胼胝質(zhì)包圍染色體解旋后形成四個(gè)核，然后四個(gè)核之間同時(shí)發(fā)生胞質(zhì)分裂，分裂成由胼胝質(zhì)壁包圍的四分孢子，即四分體。單核早、中期的花粉小孢子細(xì)胞體積變大，小孢子細(xì)胞中心有一個(gè)較大的細(xì)胞核，細(xì)胞有明顯的細(xì)胞壁且細(xì)胞質(zhì)中未發(fā)現(xiàn)液泡。隨后花粉細(xì)胞體積持續(xù)增加，細(xì)胞呈正圓形，細(xì)胞核靠近細(xì)胞壁和顯現(xiàn)萌發(fā)孔，即單核靠邊期。單核靠邊期的后期進(jìn)行有絲分裂，通過有絲分裂產(chǎn)生兩個(gè)細(xì)胞核，體積大的為營養(yǎng)核，靠近液泡；體積小的為生殖核，貼近花粉壁。圖2

注：圖1-A、1-B、1-C為3個(gè)品種花蕾外部形態(tài)圖；圖1-D、1-E、1-F從相對應(yīng)的上排花蕾中解剖的花藥外部形態(tài)圖。(標(biāo)尺=50 um)

Note: Figure 1-A, 1-B, 1-C are external morphological maps of three varieties of buds; Figure 1-D, 1-E, 1-F are external anatomical figures of anthers dissected from corresponding upper row buds. (Scale=50 um)

圖1 3個(gè)雜交組合加工番茄小孢子各發(fā)育時(shí)期花蕾和花藥外部形態(tài)
Fig.1 Processing tomato of buds and anther external morphology of tomato microspores in three hybrid combinations

注：A.四分體時(shí)期(40×10)；B. 單核早、中期 (40×10)；C.單核靠邊期(40×10)；D.雙核期(40×10)(標(biāo)尺=20 um)

Note:A． Tetrad; B． Early and mid - uninucleate; C．uninucleate; D． Binucleate

圖2 加工番茄花粉小孢子各發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞學(xué)特征
Fig.2 Cytological characteristics of pollen microspores at various developmental stages in processing tomato

2.3 花蕾長度與花粉小孢子單核靠邊期的關(guān)系

加工番茄雜交組合，不同花蕾長度不同的花粉小孢子單核靠邊期比例存在顯著性差異。C2和 C3這2個(gè)番茄品種的花蕾長度在5.00～5.99 mm 時(shí)與其它5個(gè)長度區(qū)組之間差異顯著，在該長度范圍內(nèi)，2個(gè)加工番茄品種的單核靠邊期的小孢子所占比例分別為61.88% 和53.75%。C1品種的花蕾長度在6.00～6.99 mm 時(shí)與其它5個(gè)長度區(qū)組之間差異顯著，在該長度范圍內(nèi)，單核靠邊期的小孢子所占比例為61.59% 。該番茄品種的花蕾長度在 3.00～3.99 mm與7.00～7.99 mm 和8.00及8.00 mm以上時(shí)，花粉小孢子的單核靠邊期比例在4%到10%之間，花粉小孢子單核靠邊期比例差異不顯著。但是當(dāng)花蕾長為3.00～3.99 mm和8.00及8.00 mm以上時(shí)，此3個(gè)番茄品種的單核靠邊期比例基本都小于10%。雜交組合C1花蕾長度在6.00～6.99 mm 時(shí)，C2和C3花蕾長度在 5.00～5.99 mm花粉小孢子的單核靠邊期比例最高，可以將花蕾長度作為番茄花藥培養(yǎng)試驗(yàn)研究中的采樣指標(biāo)之一。表1

表1 不同花蕾長度區(qū)組的加工番茄花粉小孢子單核靠邊期比例
Table 1 Percentages of uninucleate microspores in anthers of Processing tomato at different developmental stages

花蕾長度Flower buds (mm)單核靠邊期比例 Percentages of uninucleate microspores (%)C1C2C33.00～3.993.21 ±0.10Dd6.62 ±0.20Cc10.83±0.26Dd4.00～4.9917.41±0.33Cc30.71±0.37Bb20.37±0.35Cc5.00～5.9943.27±0.40Bb61.88±0.33Aa53.75±0.39Aa6.00～6.9961.59±0.32Aa27.70±0.33Bb36.24±0.38Bb7.00～7.9910.71±0.25CDcd14.68±0.24Cc22.45±0.32Cc8.00及8.00以上4.54±0.18Dd5.80±0.18Cc7.32±0.19Dd

注: 不同小寫字母表示在 0.05水平下差異顯著，不同大寫字母表示在0.01水平下差異顯著

Note: Different lowercase letters expressed significant difference at the 0.05 level，different capital letters expressed significant difference at the 0.01 level

3 討 論

3.1 小孢子發(fā)育時(shí)期與花器形態(tài)的相關(guān)性

加工番茄小孢子的發(fā)育階段與花器各項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)具有相關(guān)性，不同品種加工番茄相同小孢子發(fā)育時(shí)期所對應(yīng)的花器外部形態(tài)存在一定的差異。前人研究發(fā)現(xiàn)[9-11]，當(dāng)花藥為綠色且花藥末端略帶淡紫色時(shí)，小孢子的發(fā)育時(shí)期在單核期與雙核早期之間，處于第一次有絲分裂時(shí)期，小孢子比較有可能向單倍體方向發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)小孢子處于單核靠邊期時(shí)，花蕾和花藥的形態(tài)特征是：花蕾膨大、微微張開、萼片黃綠色，花藥顏色為黃綠色易剝離。

3.2 小孢子發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞學(xué)特征

試驗(yàn)小孢子發(fā)育時(shí)期的觀察采用醋酸洋紅染色法，通過在顯微鏡下觀察花粉小孢子的發(fā)育情況，對小孢子不同發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞學(xué)特征進(jìn)行研究。通過顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)加工番茄小孢子發(fā)育時(shí)期大致分為四個(gè)時(shí)期。每個(gè)時(shí)期可以根據(jù)細(xì)胞核的數(shù)量，位置以及其他明顯特征進(jìn)行簡單的區(qū)分。此外，彭真、張永華等均研究發(fā)現(xiàn)[12-13]，四分體時(shí)期是小孢子母細(xì)胞分裂成由胼胝質(zhì)壁包圍的四分孢子，即四分體時(shí)期；單核早、中期的花粉小孢子細(xì)胞中心有一個(gè)較大的細(xì)胞核，細(xì)胞有明顯的細(xì)胞壁且細(xì)胞質(zhì)中未發(fā)現(xiàn)液泡細(xì)胞呈正圓形；細(xì)胞核靠近細(xì)胞壁和顯現(xiàn)萌發(fā)孔，即單核靠邊期；雙核期產(chǎn)生兩個(gè)細(xì)胞核，體積大的為營養(yǎng)核，靠近液泡，體積小的為生殖核，貼近花粉壁。

3.3 花蕾長度與花粉小孢子單核靠邊期的關(guān)系

利用花藥培養(yǎng)技術(shù)可獲得單倍體或純合二倍體植株，可縮短育種年限，但是不是任何發(fā)育時(shí)期的花粉小孢子在培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)能誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體或愈傷組織。只有發(fā)育到特定的時(shí)期，加工番茄小孢子較適宜的時(shí)期為單核靠邊期。此外，在園藝植物甘藍(lán)中發(fā)現(xiàn)，花蕾長度在 4.5～5.49 mm 時(shí)，小孢子多數(shù)處于單核靠邊期，較容易誘導(dǎo)出胚狀體[14]。江偉等[15]在大白菜游離小孢子培養(yǎng)中得出，當(dāng)花蕾長度在 2.0～2.5 mm，單核靠邊期比例高，產(chǎn)胚量最高。就多數(shù)植物而言,單核中期至晚期的花粉最容易形成花粉胚或花粉愈傷組織。一般認(rèn)為花蕾的長度、瓣藥比是判斷小孢子發(fā)育階段的可靠指標(biāo)[16]。試驗(yàn)通過鏡檢發(fā)現(xiàn)雜交組合C1花蕾長度在 6.00～6.99 mm 時(shí)，C2和 C3花蕾長度在 5.00～5.99 mm花粉小孢子大多數(shù)處于單核靠邊期，因此，可以將花蕾長度作為加工番茄取材時(shí)期的參考指標(biāo)。

4 結(jié) 論

不同品種加工番茄相同小孢子發(fā)育時(shí)期所對應(yīng)的花器外部形態(tài)存在一定的差異。雜交組合C1花蕾長度在 6.00～6.99 mm 時(shí)，C2和 C3花蕾長度在 5.00～5.99 mm花粉小孢子大多數(shù)處于單核靠邊期。此時(shí)花蕾外觀和花藥的形態(tài)特征是：花蕾膨大、微微張開、萼片黃綠色，花藥顏色為黃綠色易剝離。影響花藥培養(yǎng)的因素之一是花粉發(fā)育時(shí)期，花粉發(fā)育時(shí)期與花蕾或花藥形態(tài)密切相關(guān)，對于花藥離體培養(yǎng)來說不是任何發(fā)育時(shí)期的小孢子都合適。前人對小孢子發(fā)育時(shí)期的研究認(rèn)為[17-20]，小孢子處于單核后期時(shí)，花藥培養(yǎng)比較容易成功。此外，在大規(guī)模的植物組培生產(chǎn)過程中，利用顯微鏡觀察每一個(gè)花蕾所處小孢子發(fā)育時(shí)期是不可能的。在進(jìn)行加工番茄單倍體育種時(shí)，可以根據(jù)此時(shí)期的特點(diǎn)，通過測量加工番茄花蕾長度，鑒定小孢子的發(fā)育時(shí)期。

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