LC-MS/MS測定血液、肝組織中的歐夾竹桃苷

翟金曉，嚴(yán) 慧，沈 敏，沈保華，劉 偉

（1.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063；2.濟寧醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，山東 濟寧 272067）

夾竹桃（Nerium oleander）又名洋夾竹桃或歐洲夾竹桃，是一種夾竹桃科的常綠灌木或小喬木，具有觀賞價值。夾竹桃因其毒性而聞名，也是世界上最毒的植物之一[1]，人類和家畜因夾竹桃中毒甚至死亡的案（事）件時有報道[2-5]。攝入夾竹桃會產(chǎn)生典型的強心苷中毒臨床癥狀[6-7]，主要表現(xiàn)為胃腸道不適、惡心和嘔吐，其次為神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，包括虛弱、精神錯亂和心臟癥狀，通常表現(xiàn)為由于傳導(dǎo)問題引起的心動過緩和房室傳導(dǎo)阻滯導(dǎo)致纖顫[8]。歐夾竹桃苷是夾竹桃的主要毒性成分，屬遲效強心苷類，分布于夾竹桃植物的各個部位，包括莖、葉、嫩芽、花、花蜜、樹液、燃燒后的產(chǎn)物等[9]。歐夾竹桃苷的定量檢測可以為夾竹桃中毒的判斷提供直接證據(jù)[10]。

目前對體內(nèi)歐夾竹桃苷的檢測方法主要有薄層色譜法[11]、熒光分光光度法[12]、高效液相色譜法[13]和質(zhì)譜法[14-15]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）結(jié)合了液相色譜分離效率高和質(zhì)譜化合物鑒定功能強的優(yōu)點，是分析生物樣品中復(fù)雜和難以揮發(fā)的強心苷的理想方法[16]。在法庭毒物學(xué)領(lǐng)域，夾竹桃中毒的鑒定涉及生物檢材的有效性、檢測目標(biāo)物的穩(wěn)定性、分析方法的可靠性和靈敏性等問題，不同組織中歐夾竹桃苷的定性定量檢測可為上述問題提供重要的指導(dǎo)信息。本研究將建立液液提取-LC-MS/MS技術(shù)檢測血液、肝組織中歐夾竹桃苷的分析體系，并進行全面的方法學(xué)驗證，同時將所建立的方法應(yīng)用于實際夾竹桃中毒死亡案例。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器

API 4000 Q TRAP四極桿-線性離子阱質(zhì)譜儀（美國AB公司）配備AcquityTMUltra Performance LC超高效液相色譜儀（美國Waters公司），TDZ4-WS離心機（湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司），MiniSpin?離心機（德國Eppendorf公司），DK-S22型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），XW-80A渦旋混合器（上海醫(yī)大儀器有限公司），HR2860攪拌機（荷蘭Philips公司），Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.1.2 樣品與試劑

空白全血（經(jīng)肝素抗凝）由上海市血液中心提供，空白肝組織為市售新鮮豬肝。

乙腈（HPLC級）、甲醇（HPLC級）和甲酸（優(yōu)級純）均購自美國Sigma-Aldrich公司，冰乙酸（分析純）、乙醚（分析純）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，超純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得。歐夾竹桃苷對照品（純度≥98%，規(guī)格為20mg）購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制

稱取對照品歐夾竹桃苷10 mg于10 mL容量瓶中，精密稱定，加入甲醇溶解，稀釋，定容，配制成質(zhì)量濃度為1mg/mL的歐夾竹桃苷甲醇儲備液，置于冰箱中冷凍保存，待用。實驗中所用其他濃度的對照品溶液均由上述對照品儲備液稀釋而得。

1.2.2 樣品前處理方法

取血液1mL或肝組織（已研磨成勻漿）1g，用2mL乙醚進行提取，渦旋混合3 min，以離心半徑12 cm，2 500 r/min，離心3 min。將上清液轉(zhuǎn)移至另一試管中，水浴60℃下?lián)]干。殘留物中加入200 μL甲醇復(fù)溶，供LC-MS/MS分析。

1.2.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱（150mm×2.1mm，5μm），前接Phenomenex保護柱；以20 mmol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）溶液為流動相A，乙腈為流動相B，進行梯度洗脫。梯度洗脫程序見表1。流速：0.2mL/min；柱溫：25℃；進樣量：10μL。

表1 梯度洗脫程序 （%）

質(zhì)譜條件：采用電噴霧正離子化（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式檢測；離子源電壓（IS）4500V，氣簾氣（CUR）25psi，霧化氣（GS1） 35 psi，輔助氣（GS2） 40 psi，離子源溫度（TEM）500℃。

選用歐夾竹桃苷的兩對母離子-子離子對進行定性分析，分別為m/z577.4/373.3、m/z577.4/355.3，將離子對m/z577.4/373.3作為定量離子對。

1.3 方法學(xué)驗證

對本研究建立的LC-MS/MS分析方法進行方法學(xué)驗證[17]，主要包括選擇性、線性、檢出限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantification，LOQ）、精密度、準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率。

選擇性：通過分析10份不同來源的空白血液和空白肝組織樣品來評估該方法的選擇性，以考察內(nèi)源性物質(zhì)對目標(biāo)物檢測的干擾。

線性、LOD、LOQ：采用空白血液和空白肝組織制備加標(biāo)樣品獲得校準(zhǔn)曲線。添加歐夾竹桃苷適量至空白血液和空白肝組織中，得到5、10、50、100、250、400、500ng/mL及20、50、200、500、1000、1600、2000ng/g的歐夾竹桃苷添加樣品。通過最小二乘法擬合得線性方程（y=ax+b，y為目標(biāo)物峰面積，x為目標(biāo)物濃度）和相關(guān)系數(shù)。逐級降低添加樣品中歐夾竹桃苷含量進行分析，直至目標(biāo)物的信噪比（S/N）≥3，從而確定血液和肝組織中的LOD，并將LOQ定義為S/N≥10的目標(biāo)物濃度。

精密度、準(zhǔn)確度：分別取空白血液1 mL、空白肝組織1g各若干份，加入歐夾竹桃苷適量，制得低、中、高三個質(zhì)量濃度（10、100、400 ng/mL）的血液質(zhì)量控制樣品及低、中、高三個質(zhì)量分?jǐn)?shù)（50、500、1600ng/g）的肝組織質(zhì)量控制樣品，每一濃度均為6份。以當(dāng)日校準(zhǔn)曲線測得各樣品中歐夾竹桃苷的含量，計算各質(zhì)量控制樣品的準(zhǔn)確度和日內(nèi)精密度[以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示]。同法連續(xù)測定4 d，計算日間精密度。質(zhì)量控制樣品的精密度和準(zhǔn)確度要求在±15%以內(nèi)。

基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率：分別取空白血液1mL、空白肝組織1 g各若干份，加入歐夾竹桃苷適量，制得低、中、高三個質(zhì)量濃度（10、100、400 ng/mL）的血液質(zhì)量控制樣品及低、中、高三個質(zhì)量分?jǐn)?shù)（50、500、1 600 ng/g）的肝組織質(zhì)量控制樣品，每一濃度均為6份。按照1.2.2節(jié)方法進行樣品前處理后進樣分析，所得各樣品目標(biāo)物的峰面積為A；相同的空白基質(zhì)同法處理后，在吹干的殘留物中加入適量歐夾竹桃苷對照品配制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的溶液，定容，進樣分析，所得各樣品中的峰面積為B；提取回收率=A/B×100%。另取相應(yīng)質(zhì)量濃度的對照品溶液，吹干后用甲醇定容后進樣分析，測得目標(biāo)物的峰面積為C，基質(zhì)效應(yīng)=B/C×100%[18]。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

本研究前期考察了幾種不同填料的色譜柱對樣品進行分析，發(fā)現(xiàn)Restek Ultra Aqueous C18色譜柱（50mm×2.1mm，5μm）及其他規(guī)格的C18柱對樣品的分離效果不理想，峰形有拖尾，而使用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（150mm×2.1mm，5μm）分析時，歐夾竹桃苷峰形較窄且對稱，靈敏度也較高，故本研究選擇Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱用于生物檢材中歐夾竹桃苷的定性定量分析。

2.2 方法驗證

選擇性實驗結(jié)果顯示，空白樣品在目標(biāo)物出峰時間處無響應(yīng)，以血液樣品為例，空白血液的MRM色譜圖見圖1。空白血液中加入目標(biāo)物歐夾竹桃苷（5ng/mL）后按照樣品前處理方法操作，進樣分析，結(jié)果見圖2，歐夾竹桃苷的保留時間為4.80min。比較兩者的MRM色譜圖可得知空白樣品中內(nèi)源性基質(zhì)對目標(biāo)物質(zhì)歐夾竹桃苷無干擾，方法的選擇性良好。

圖1 空白血液樣品的MRM色譜圖

圖2 空白血液中添加歐夾竹桃苷的MRM色譜圖

線性、LOD、LOQ結(jié)果見表2。血液和肝組織中歐夾竹桃苷在各自的線性范圍內(nèi)均呈現(xiàn)出良好的線性。血液或肝組織的LOD低至1ng/mL或2ng/g，可滿足司法鑒定實踐的要求。

精密度、準(zhǔn)確度結(jié)果見表3～4。血液及肝組織中歐夾竹桃苷準(zhǔn)確度為98.42%～111.63%，日內(nèi)精密度為2.75%～10.45%，日間精密度為5.99%～10.71%，表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度均滿足要求。

基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率結(jié)果見表3～4。各質(zhì)量控制樣品中的歐夾竹桃苷提取回收率均大于70.50%，表明乙醚液液提取的前處理方法可達到較滿意的提取效率。基質(zhì)效應(yīng)范圍為91.52%～106.39%，無明顯基質(zhì)影響。

表2 血液和肝組織中歐夾竹桃苷的線性范圍、回歸方程、LOD和LOQ

表4 肝組織中歐夾竹桃苷的精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) （%）

2.3 案例應(yīng)用

2.3.1 簡要案情

某女，25歲，患間歇性精神病多年，一直未得到較好的醫(yī)治，病情反復(fù)發(fā)作。其父依照游醫(yī)的配方將25片新鮮夾竹桃葉（圖3）剪碎，用紗布包好后，用木棒搗碎，邊搗邊加溫開水，處理約1 h，最后制得約125mL湯汁給該女服下。約20min后該女即出現(xiàn)惡心、嘔吐等癥狀，并逐漸加重，嘔吐不停，于服藥后4.5 h死亡，期間未進行任何治療。當(dāng)?shù)鼐绞芾泶税负?，對死者進行了尸體解剖。尸體解剖見心肌點灶狀出血，多器官淤血，肝細胞、腦神經(jīng)元變性。采集該女的心血、尿液、肝組織、胃內(nèi)容物等檢材經(jīng)常規(guī)毒（藥）物檢驗結(jié)果均為陰性。

圖3 新鮮的夾竹桃葉子

2.3.2 檢測結(jié)果

將本研究建立的方法應(yīng)用于本例疑似夾竹桃中毒案件中，對夾竹桃葉、葉渣以及死者體內(nèi)的歐夾竹桃苷進行檢測，各檢材中歐夾竹桃苷的含量見表5。

有文獻[3]報道，新鮮夾竹桃葉的致死量為20～30片。在本案例中，取夾竹桃葉剪碎、研磨，加水超聲10min后按本研究所建立的方法提取進樣分析，發(fā)現(xiàn)在夾竹桃葉片中歐夾竹桃苷含量非常高，達0.481mg/g，服用少許夾竹桃葉湯汁即可達到中毒劑量，易致死。煮后夾竹桃葉渣為本案例中的體外檢材，可看出剩余的藥渣中歐夾竹桃苷含量仍很高，達0.047mg/g。

由表5可以看出，在死者胃內(nèi)容物中歐夾竹桃苷含量最高，為29600.0ng/g，約為夾竹桃葉含有的歐夾竹桃苷濃度的1/16，其次含量較高的生物檢材是胃壁組織（13700.0ng/g），約為胃內(nèi)容物中含量的一半，這可能是因為歐夾竹桃苷在口服攝入后很容易被胃腸道吸收[19]。一般情況下，死亡距攝藥約4.5h時，胃內(nèi)還未排空，這可能是導(dǎo)致胃內(nèi)容物和胃壁組織含量如此之高的原因。

表5 各檢材中歐夾竹桃苷的含量

本例膽汁中歐夾竹桃苷的含量為8010.0ng/mL，肝組織中為1 610.0 ng/g。肝組織是藥物的主要清除器官，肝組織清除分為肝代謝和膽汁排泄兩種方式。據(jù)報道[19]，歐夾竹桃苷的主要排泄途徑是通過膽汁排泄到糞便，所以膽汁中的歐夾竹桃苷含量高于肝組織中的歐夾竹桃苷含量，這也提示膽汁是中毒死亡案例中確認(rèn)歐夾竹桃苷的較好檢材。一般毒物的排泄途徑除了糞便還有尿液，本例尿液中歐夾竹桃苷的質(zhì)量濃度為254.0ng/mL，高于心血中歐夾竹桃苷的質(zhì)量濃度（65.5ng/mL）。心血中的歐夾竹桃苷含量比其他生物檢材均低，可能是灌胃給藥后主要通過膽道迅速排泄[20]所致。

本案例將收集到的多種生物檢材首先進行了常規(guī)毒（藥）物檢驗，結(jié)果均為陰性，隨即運用本研究所建立的方法進行夾竹桃中毒檢測分析，結(jié)果在死者各生物檢材中均檢出較高含量的歐夾竹桃苷。尸體檢驗未見致命性機械性損傷和機械性窒息的尸體征象，結(jié)合案情，本例死者的死亡原因為夾竹桃中毒。

3 結(jié) 論

本研究建立了采用LC-MS/MS檢測血液、肝組織中歐夾竹桃苷的分析方法，并進行了全面的方法學(xué)驗證，且成功應(yīng)用于實際中毒死亡案例，對多種生物檢材進行定量分析。此方法操作簡便、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高、靈敏度高，能滿足司法鑒定對科學(xué)證據(jù)的要求。該法可應(yīng)用于司法鑒定實踐及臨床診斷，為夾竹桃中毒的法醫(yī)學(xué)鑒定提供技術(shù)支撐，為該類中毒案例的取材及結(jié)果判斷提供參考信息。