蕎麥殼提取物有效組分的分離及體外抗糖尿病活性

趙梓瀛，樸春紅,*，王玉華，劉俊梅，于寒松，代偉長(zhǎng)，唐玉芳，王 婧，劉岱琳*

蕎麥屬蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum），起源于我國(guó)[1]。其農(nóng)業(yè)種植的兩個(gè)重要品種分別是甜蕎麥（F. esculentum Moench）和苦蕎麥（F. tataricum（L.）Gaertn.）。甜蕎麥在世界分布廣泛，苦蕎麥為我國(guó)獨(dú)有農(nóng)作物[2]。我國(guó)的苦蕎種植面積和產(chǎn)量均居世界第一位[3]。蕎麥作為一種藥食同源的天然綠色食品資源，含有較多的生物黃酮類(lèi)物質(zhì)。黃酮類(lèi)物質(zhì)通過(guò)抗氧化、抑制α-葡萄糖苷酶活性、擬胰島素作用、抗炎、抑制醛糖還原酶和抑制蛋白糖基化等多種途徑來(lái)防治糖尿病，同時(shí)通過(guò)抵抗血小板凝集、微血管病變等作用改善糖尿病并發(fā)癥[4]。傳統(tǒng)治療糖尿病的藥物都具有不同程度的副作用，因此在天然產(chǎn)物中尋找α-葡萄糖苷酶抑制劑、蛋白質(zhì)糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycosylation end products，AGEs）抑制劑成為糖尿病治療領(lǐng)域研究的熱門(mén)方向。

蕎麥殼是蕎麥生產(chǎn)加工中的副產(chǎn)物，且產(chǎn)量大、價(jià)格低廉。其藥理作用和有效化學(xué)成分與蕎麥具有相似之處，但目前對(duì)其藥理研究和開(kāi)發(fā)利用較少[5]。近幾年研究表明蕎麥成分對(duì)慢性疾病治療有突出的效果，因此倍受食品科學(xué)家的重視[6]。很多文獻(xiàn)證實(shí)蕎麥提取物具有降血糖、抑制AGEs形成的功效[7-8]。本課題組前期研究結(jié)果表明，蕎麥殼黃酮提取物可顯著降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠空腹血糖含量，同時(shí)證實(shí)其還具有修復(fù)胰島細(xì)胞功能，且具有量效關(guān)系[9]。為了深入研究蕎麥殼黃酮類(lèi)物質(zhì)成分及其與抗糖尿病活性的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)對(duì)蕎麥殼提取物（buckwheat hull extract，BHE）進(jìn)一步分離純化后，研究各組分體外抗糖尿病生物活性并對(duì)活性最優(yōu)組分進(jìn)行成分分析，為蕎麥殼活性及成分鑒定提供有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜蕎麥殼購(gòu)于內(nèi)蒙古赤峰市；BHEs制取參照樸春紅等[10]的方法。

蘆?。兌取?8%） 美國(guó)Bellancom Life Science公司；α-葡萄糖苷酶（＞10 000 U） 北京Solarbio公司；葡萄糖氧化酶試劑盒 上海恒遠(yuǎn)試劑公司；D101大孔樹(shù)脂、AB-8大孔樹(shù)脂 東鴻化工有限公司；葡萄糖北京化工廠；D-果糖、牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、丙酮醛（methylglyoxal，MGO） 美國(guó)Sigma公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；iFD-1P-50冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；infinite M200酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；3K15離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；SYNERGYHT多功能酶標(biāo)儀美國(guó)伯騰儀器有限公司；DHP/20恒溫培養(yǎng)箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；LCMS2020型高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatograph-mass spectrometer，HPLC-MS）聯(lián)用儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 大孔樹(shù)脂分離純化

1.3.1.1 大孔樹(shù)脂的預(yù)處理

參照胡月等[11]的方法并加以改進(jìn)。分別將D101大孔樹(shù)脂、AB-8大孔樹(shù)脂用95%乙醇浸泡24 h，對(duì)其進(jìn)行初步除雜。濾去乙醇，用蒸餾水洗至無(wú)味。依次用4% HCl和4% NaOH溶液浸泡24 h，每次浸泡結(jié)束后用蒸餾水洗至pH 7.0，最后浸泡于95%乙醇中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 D101大孔樹(shù)脂一次純化

處理好的D101大孔樹(shù)脂濕法裝柱，待柱料平穩(wěn)后，以2 mL/min流速加入BHE溶液100 mL，待BHE吸附后，蒸餾水以4 BV/h流速洗去未吸附的BHE樣品，最后用70%乙醇以2 BV/h流速洗脫至流出液無(wú)顏色，洗脫液冷凍干燥后獲得D101大孔樹(shù)脂精制物（purified buckwheat hull extract，PBHE）備用。

1.3.1.3 AB-8大孔樹(shù)脂二次純化

處理好的AB-8型大孔樹(shù)脂濕法裝柱，待柱料平穩(wěn)后，以0.5 BV/h流速加入20 mL PBHE樣品，2 BV/h流速洗脫。洗脫劑依次為純水2 BV（BHE-M1）、純水3 BV（BHE-M2）、10%乙醇4 BV（BHE-M3）、40%乙醇11 BV（BHE-M4）、95%乙醇4 BV（BHE-M5）。分別收集洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥后得到AB-8大孔樹(shù)脂純化組分（BHE-M）備用。

1.3.2 總黃酮含量測(cè)定

利用NaNO2-Al(NO3)3比色法來(lái)檢測(cè)各分離純化組分總黃酮含量[12]。500 μL待測(cè)樣品液與1.0 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇混合后加入250 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% NaNO2溶液，靜置反應(yīng)6 min，加250 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% Al(NO3)3溶液于上述反應(yīng)液中再靜置反應(yīng)6 min，最后加入1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% NaOH溶液混勻。分別取出200 μL加至96 孔板中，利用酶標(biāo)儀在510 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其吸光度。參照上述方法制備蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，取0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、1.00、1.50 mL作為樣品，510 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；得到線性回歸方程為Y＝0.297 6X＋0.052 2，R2＝0.999 4，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各總黃酮含量。

1.3.3 α-葡萄糖苷酶活力抑制率測(cè)定

以麥芽糖為底物，α-葡萄糖苷酶活力抑制率測(cè)定方法參照范文婭[13]、韓淑英[14]等的報(bào)道并加以改良。依次取60 μL乙酸-乙酸鈉緩沖液，40 μL α-葡萄糖苷酶（5 mg/mL），80 μL麥芽糖（20 mmol/L）于1.5 mL EP管中混勻，加入20 μL待測(cè)樣品溶液（1.25、2.50、10.00 mg/mL），40 ℃溫育40 min后沸水加熱5 min終止反應(yīng)。離心2 min（4 ℃、1 000 r/min），取上清液10 μL于1.5 mL EP管中，加入葡萄糖氧化酶試劑盒中R1、R2混合液1 000 μL，37 ℃溫育15 min，取200 μL至96 孔板中，505 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。計(jì)算公式如式（1）所示。

式中：A空白為不加樣品的吸光度；A樣品為各質(zhì)量濃度樣品孔的吸光度；A顏色對(duì)照為顏色對(duì)照孔的吸光度。

1.3.4 AGEs抑制率測(cè)定

1.3.4.1 葡萄糖-BSA、果糖-BSA體系制備

參照Wang Xuan等[15]的方法進(jìn)行并略作改動(dòng)：分別用磷酸鹽緩沖液（200 mmol/L、pH 7.4）配制10 mg/mL的BSA溶液、500 mmol/L的葡萄糖溶液和果糖溶液、不同質(zhì)量濃度的實(shí)驗(yàn)樣品（BHE、PBHE、BHE-M）。1.5 mL EP管中依次加入120 μL葡萄糖溶液（果糖溶液）、240 μL BSA溶液、反應(yīng)終質(zhì)量濃度為0.025、0.050、0.200 mg/mL的實(shí)驗(yàn)樣品。密封好EP管，80 ℃避光條件下培養(yǎng)6 h后分別取200 μL至黑色酶標(biāo)板中測(cè)定AGEs生成量。實(shí)驗(yàn)分組如下：空白對(duì)照組（不含還原糖和抑制劑）、對(duì)照組（不含抑制劑）、實(shí)驗(yàn)組（抑制劑為實(shí)驗(yàn)樣品）、陽(yáng)性對(duì)照組（抑制劑為胺基胍（amino guanidine，AG））。

1.3.4.2 MGO-BSA體系制備

MGO-BSA體系制備參照Harsha[16]和Pokkaew[17]等的方法略有改動(dòng)：1 mL MGO（20 mmol/L）加到20 mL BSA（20 mg/mL）溶液中，取上述MGO-BSA混合液280 μL至黑色酶標(biāo)板中，對(duì)應(yīng)加入20 μL實(shí)驗(yàn)樣品（BHE、PBHE、BHE-M），反應(yīng)中所用溶劑皆為磷酸鹽緩沖液（100 mmol/L、pH 7.4）。充分混勻后50 ℃避光條件下培養(yǎng)24 h后測(cè)定AGEs生成量。實(shí)驗(yàn)分組為：空白對(duì)照組（不含MGO和抑制劑）、對(duì)照組（不含抑制劑）、實(shí)驗(yàn)組（抑制劑為實(shí)驗(yàn)樣品）、陽(yáng)性對(duì)照組（抑制劑為AG）。

1.3.4.3 AGEs抑制率檢測(cè)

利用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)360 nm和發(fā)射波長(zhǎng)460 nm，增益50的條件下，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，計(jì)算公式如式（2）所示。

式中：FLs為實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度；FLb為空白組的熒光強(qiáng)度；FLc為對(duì)照組的熒光強(qiáng)度。

1.3.5 BHE-M4中黃酮類(lèi)物質(zhì)成分分析

1.3.5.1 樣品的準(zhǔn)備

精密稱取BHE-M4樣品100 mg，置于50 mL錐形瓶中，加入25 mL甲醇后密封瓶口，超聲處理1 h（40 kHz、250 W），冷卻后過(guò)濾，少量甲醇洗滌濾渣并將洗滌液與濾液合并，減壓加熱干燥。

干燥后的樣品用90%甲醇水溶液溶解，過(guò)C18固相萃取小柱，90%甲醇水溶液為洗脫液，棄去前1 mL洗脫液，接收中間3 mL洗脫液，真空干燥后備用。

1.3.5.2 HPLC-MS分析條件

取1.3.5.1節(jié)干燥樣品以甲醇溶解后經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取10 μL樣品進(jìn)樣分析。使用LCMS2020型HPLC-MS聯(lián)用儀，掃描速率為15 000 D/s，正負(fù)極性切換時(shí)間為15 ms。乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，洗脫條件：0～40 min，流動(dòng)相A：5%～90%；40～45 min，流動(dòng)相A：90%；45～50 min，流動(dòng)相A：90%～5%。流速：1 mL/min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 各組分總黃酮含量

圖1 大孔樹(shù)脂純化組分中總黃酮含量Fig. 1 Total ぼavonoid contents of BHE and its fractions

BHE經(jīng)兩種不同型號(hào)大孔樹(shù)脂純化后，各組分總黃酮含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。BHE總黃酮含量為30.8 g/100 g，經(jīng)D101大孔樹(shù)脂一次純化后總黃酮含量升高約一倍，為65.3 g/100 g。經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂二次純化后黃酮類(lèi)化合物基本集中在BHE-M4和BHE-M5兩個(gè)組分，其中BHE-M4組分總黃酮含量為89.2 g/100 g。楊喆等[18]以D101大孔樹(shù)脂分純化山杏核殼總黃酮，總黃酮含量達(dá)到51.63%；楊芙蓮等[19]以AB-8大孔樹(shù)脂甜蕎麥殼類(lèi)總黃酮含量由27.9%提高到59.5%；陳晶等[20]用AB-8大孔樹(shù)脂分離純化枇杷花總黃酮，純化后樣品總黃酮含量達(dá)74.82%。本實(shí)驗(yàn)中BHE依次經(jīng)D101大孔樹(shù)脂、AB-8大孔樹(shù)脂兩次純化后，總黃酮含量與已有文獻(xiàn)結(jié)果相似，結(jié)果表明蕎麥殼黃酮經(jīng)大孔樹(shù)脂兩次純化后總黃酮含量有顯著提高，便于進(jìn)行后續(xù)成分分析及活性實(shí)驗(yàn)。

2.2 純化組分α-葡萄糖苷酶活力抑制率

圖2 大孔樹(shù)脂純化前后蕎麥殼提取物抑制α-葡萄糖苷酶的活性Fig. 2 Inhibitory activity of BHE and its fractions against α-glucoside

α-葡萄糖苷酶又稱α-D-葡萄糖苷水解酶，是一類(lèi)低聚糖水解酶，也是機(jī)體內(nèi)碳水化合物消化的關(guān)鍵酶，同時(shí)參與機(jī)體內(nèi)糖蛋白、糖脂和糖肽的合成。通過(guò)降解機(jī)體內(nèi)多糖，裂解α-1、α-4糖苷鍵釋放葡萄糖使機(jī)體血糖濃度升高。α-葡萄糖苷酶抑制劑雖不刺激胰島β細(xì)胞分泌胰島素，但可通過(guò)抑制這一系列反應(yīng)，降低餐后血糖水平，是比較成熟的治療糖尿病藥物，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床。李鵬程等[9]研究表明BHE具有良好的抑制α-葡萄糖苷酶活力的作用，尤其對(duì)α-葡萄糖苷酶-麥芽糖體系的降解作用高于α-葡萄糖苷酶-硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷。因此本實(shí)驗(yàn)采用α-葡萄糖苷酶-麥芽糖體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由圖2可知，除BHE-M1組分外，其他組分對(duì)α-葡萄糖苷酶活力有明顯的抑制，且呈劑量依賴關(guān)系。BHE-M4組分對(duì)α-葡萄糖苷酶活力的抑制效果最強(qiáng)，在1.000 mg/mL時(shí)抑制率最高為28.23%，而同等質(zhì)量濃度下BHE的抑制率為16.03%。陽(yáng)性對(duì)照組阿拉伯糖5 mg/mL時(shí)抑制率僅為2.94%（圖中未標(biāo)注）。朱麗艷等[21]研究表明蕎麥花總黃酮對(duì)α-葡萄糖苷酶活力抑制率分別為35.79%～54.74%，結(jié)果略高于本研究中的BHE-M4組分，而蕎麥麩皮黃酮類(lèi)物質(zhì)及小葉薜荔根莖黃酮類(lèi)物質(zhì)在低質(zhì)量濃度下抑制效果不明顯[22-23]。張海鳳等[24]分別用大鼠小腸黏膜α-葡萄糖苷酶提取液和市售α-葡萄糖苷酶建立α-葡萄糖苷酶抑制劑模型，發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源α-葡萄糖苷酶活力有一定差異。而本實(shí)驗(yàn)樣品與已發(fā)表文獻(xiàn)中蕎麥相關(guān)黃酮的α-葡萄糖苷酶活力抑制率相比較低，這可能與蕎麥產(chǎn)地、提取部位以及α-葡萄糖苷酶的來(lái)源有關(guān)。但仍然可以證明BHE分離純化后，大部分組分對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性均有不同程度的提升。

2.3 純化組分抑制AGEs活性

2.3.1 純化組分在葡萄糖-BSA、果糖-BSA體系中的AGEs抑制率

圖3 葡萄糖-BSA體系中抑制AGEs活性Fig. 3 Inhibitory effect of BHE and its fractions on AGEs formation in glucose-BSA system

圖4 果糖-BSA體系中抑制AGEs活性Fig. 4 Inhibitory effect of BHE and its fractions on AGEs formation in fructose-BSA system

BSA與人血清白蛋白具有相似性，常用于評(píng)價(jià)體內(nèi)非酶糖基化反應(yīng)。分離純化組分在不同還原糖-BSA體系中抑制AGEs生成結(jié)果見(jiàn)圖3（葡萄糖-BSA）和圖4（果糖-BSA），BHE經(jīng)大孔樹(shù)脂兩次純化后除BHE-M1組分外，其他組分在葡萄糖-BSA、果糖-BSA兩個(gè)體系中顯示出極強(qiáng)的抑制AGEs活性，其中BHE-M4抑制活性最高。當(dāng)質(zhì)量濃度分別為0.025、0.050、0.200 mg/mL時(shí)BHE-M4抑制率分別為55.48%、57.16%、69.92%，分別高于同體系A(chǔ)G的抑制率22.85%、34.15%、60.40%；在果糖-BSA體系中各組分抗AGEs生成活性與葡萄糖-BSA體系中的趨勢(shì)一致，BHE-M4組分仍然顯示出較高的抑制活性，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.025、0.050、0.200 mg/mL時(shí)抑制率分別為47.23%、51.94%、72.33%，而同質(zhì)量濃度AG的抑制率分別為22.51%、38.42%、60.39%（圖4）。

常見(jiàn)天然植物的黃酮對(duì)蛋白非酶糖基化反應(yīng)普遍存在抑制作用[25-27]，如蘆薈的抑制率達(dá)到95%以上。蕎麥花總黃酮也能抑制體內(nèi)外蛋白質(zhì)非酶糖基化終產(chǎn)物的形成[28]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BHE和PBHE及BHE-M組分均對(duì)蛋白質(zhì)非酶糖基化生成有較強(qiáng)的抑制作用，比AG更為顯著。

2.3.2 純化組分在MGO-BSA體系中的AGEs抑制率

除最常見(jiàn)的還原糖-BSA體系外，直接利用已知非酶糖基化反應(yīng)中生成的中間體，如MGO、乙二醛（glyoxal，GO）試劑作為提供羰基的試劑而建立的體系與葡萄糖或果糖的還原糖體系比較，該體系反應(yīng)時(shí)間更短，效率更高。研究表明蘆丁[29]、槲皮素[30]具有抑制MGO-BSA、GO-BSA、還原糖-BSA體系中AGEs形成的作用。本實(shí)驗(yàn)以MGO作為提供羰基的試劑。質(zhì)量濃度為0.025 mg/mL和0.050 mg/mL時(shí)，各組分對(duì)AGEs生成的抑制率分別在18.04%～23.34%和22.97%～32.47%范圍內(nèi)；當(dāng)質(zhì)量濃度為0.200 mg/mL時(shí)，除BHE-M1、BHE-M5組分外其余組分顯示出較高的抑制AGEs生成活性，且與BHE-M1、BHE-M5組分有顯著性差異（圖5），其中質(zhì)量濃度0.200 mg/mL時(shí)BHE、BHE-M2、BHE-M3、BHE-M4組分抑制率分別達(dá)到53.64%、57.2%、57.38%、59.13%，較同質(zhì)量濃度AG分別高出4.89%、8.45%、8.63%、10.38%。

糖尿病的危害主要在于其高糖高脂引發(fā)的糖尿病并發(fā)癥。大量研究證實(shí)，引發(fā)糖尿病并發(fā)癥的根本物質(zhì)是AGEs。研究表明，AGEs在糖尿病及其并發(fā)癥如糖尿病腎病[31]、動(dòng)脈粥樣硬化[32]、糖尿病視網(wǎng)膜病變、阿爾茨海默癥[33]等疾病的發(fā)生以及發(fā)展過(guò)程中起著主要作用。已經(jīng)有報(bào)道證實(shí)，高AGEs飼料可促進(jìn)糖尿病鼠和正常鼠的腎功能惡化[34]，而苦蕎提取物具有抑制大鼠體內(nèi)蛋白非酶糖基化反應(yīng)的作用[35]。本實(shí)驗(yàn)采用的3 個(gè)蛋白糖基化體系中除BHE-M1組分外，各組分均顯示出較強(qiáng)的抑制AGEs活性，其中BHE-M4組分活性最高，該組分也是黃酮類(lèi)物質(zhì)富集的組分（圖1）。

2.4 BHE-M4組分黃酮類(lèi)物質(zhì)分析

圖6 BHE-M4組分的總離子流圖（A）及化合物的正負(fù)離子質(zhì)譜圖（B）Fig. 6 Total ion chromatogram of BHE-M4 (A) and mass chromatograms of the compounds separated from it in positive and negative ion modes (B)

α-葡萄糖苷酶活力和抗蛋白質(zhì)糖基化終末產(chǎn)物抑制率測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃酮含量高的組分即BHE-M4組其生物活性最高，因此采用HPLC-MS技術(shù)對(duì)BHE-M4組進(jìn)行成分分析。通過(guò)總離子流圖（圖6A）、正負(fù)離子質(zhì)譜圖（圖6B）共得到5 個(gè)化合物，對(duì)5 個(gè)化合物進(jìn)行推斷?；衔?：正負(fù)離子出峰m/z分別為449和447，推測(cè)分子質(zhì)量為448，m/z 287為[山奈酚＋H]＋，推測(cè)苷元為山奈酚，結(jié)構(gòu)中含有1 個(gè)半乳糖或者1 個(gè)葡萄糖。根據(jù)文獻(xiàn)[36]推斷該化合物為山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷或山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷；化合物2：正負(fù)離子出峰m/z分別為433和431，推測(cè)該分子質(zhì)量為432，根據(jù)文獻(xiàn)[37]推斷該化合物為牡荊素?；衔?：正負(fù)離子出峰m/z分別為611和609，推測(cè)分子質(zhì)量為610，m/z 303為[槲皮素＋H]＋，推測(cè)苷元為槲皮素，結(jié)構(gòu)中含有1 個(gè)葡萄糖和1個(gè)鼠李糖，推測(cè)為蕓香糖（蘆丁糖）。根據(jù)文獻(xiàn)[36]推斷該化合物為蘆丁?；衔?：正負(fù)離子出峰m/z分別為465和463，推測(cè)分子質(zhì)量為464，m/z 303為[槲皮素＋H]＋，推測(cè)苷元為槲皮素，結(jié)構(gòu)中含有1 個(gè)葡萄糖和1 個(gè)半乳糖，根據(jù)文獻(xiàn)[38]推斷該化合物為異槲皮苷或金絲桃苷，異槲皮苷和金絲桃苷具有相同的苷元和相同分子質(zhì)量的糖，且總分子質(zhì)量相同，故暫時(shí)無(wú)法進(jìn)一步推斷?；衔?：正負(fù)離子出峰m/z分別為449和447，推測(cè)分子質(zhì)量為448，根據(jù)文獻(xiàn)[39]推斷該化合物為槲皮苷。

綜上，BHE-M4中主要黃酮類(lèi)化合物可能為山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷或山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷、牡荊素、蘆丁、異槲皮苷或金絲桃苷、槲皮苷。

3 結(jié) 論

本研究將蕎麥殼提取物經(jīng)兩種型號(hào)大孔樹(shù)脂兩次純化后，分析各組分總黃酮含量、α-葡萄糖苷酶活力以及AGEs抑制率。得到的結(jié)論為高黃酮含量組分BHE-M4的α-葡萄糖苷酶活力抑制率以及AGEs抑制率最高。對(duì)BHE-M4組分繼續(xù)通過(guò)HPLC-MS進(jìn)行成分分析，共得到5 種可能的黃酮類(lèi)化合物，分別為山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷或山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷、牡荊素、蘆丁、異槲皮苷或金絲桃苷、槲皮苷。對(duì)該組分進(jìn)一步進(jìn)行定性定量分析，確定其化學(xué)成分，將是未來(lái)的主要研究方向。

[1] 史建強(qiáng), 李艷琴, 張宗文, 等. 蕎麥及其野生種遺傳多樣性分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2015, 16(3): 443-450. DOI:10.13430/j.cnki.jpgr.2015.03.002.

[2] 張輝, 曲文祥, 李書(shū)田. 內(nèi)蒙古特色作物[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社, 2010: 303-307.

[3] 王煒, 歐巧明, 楊隨莊. 苦蕎麥化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展[J]. 雜糧作物, 2010, 30(6): 419-423. DOI:10.3969/j.issn.2095-0896.2010.06.015.

[4] 方芳. 黃酮類(lèi)天然藥物有效成分治療糖尿病及其并發(fā)癥研究進(jìn)展[J].中山大學(xué)研究生學(xué)刊(自然科學(xué)、醫(yī)學(xué)版), 2007, 28(1): 39-44.

[5] 路靜靜, 趙余慶. 蕎麥皮的化學(xué)成分、生物活性及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā), 2016, 37(22): 210-213. DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2016.22.047.

[6] ZHANG Z L, ZHOU M L, TANG Y, et al. Bioactive compounds in functional buckwheat food[J]. Food Research International, 2012,49(1): 389-395. DOI:10.1016/j.foodres.2012.07.035.

[7] NIU F L, CHU J X, HAN S Y, et al. Inhibitory eあects of total ぼavones of buckwheat flower on the non-enzymatic glycation of proteins in vivo and in vitro[J]. Chinese Journal of Clinical Rehabilitation, 2006,10(43): 210-213. DOI:10.3321/j.issn:1673-8225.2006.43.048.

[8] 韓淑英, 陳曉玉, 王志路, 等. 蕎麥花總黃酮對(duì)體內(nèi)外蛋白質(zhì)非酶糖基化的抑制作用[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2004, 20(11): 1242-1244.DOI:10.3321/j.issn:1001-1978.2004.11.013.

[9] 李鵬程, 樸春紅, 張嵐, 等. 蕎麥殼黃酮提取物對(duì)2型糖尿病大鼠的血糖改善作用及機(jī)制[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(5): 244-250.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705040.

[10] 樸春紅, 劉麗蘋(píng), 初琦, 等. 熱水法提取蕎麥殼黃酮工藝優(yōu)化及抗氧化活性[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 36(6): 719-722; 734.DOI:10.13327/j.jjlau.2014.2266.

[11] 胡月, 王鴻飛, 劉飛, 等. 費(fèi)菜總黃酮分離純化工藝的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2014, 35(17): 213-216; 221. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.038.

[12] GUO X D, WU C S, MA Y J, et al. Comparison of milling fractions of tartary buckwheat for their phenolics and antioxidant properties[J].Food Research International, 2012, 49(1): 53-59. DOI:10.1016/j.foodres.2012.07.019.

[13] 范文婭, 吳正鈞, 季紅, 等. 不同干酪乳桿菌菌株對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的比較[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2012, 38(4): 29-33.DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2012.04.003.

[14] 韓淑英, 李繼安, 姜春花, 等. 10 味中藥提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用[J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2009, 24(8): 1035-1037.

[15] WANG Xuan, ZHANG Liangshuan, DONG Lulu. Inhibitory effect of polysaccharides from pumpkin on advanced glycation end-products formation and aldose reductase activity[J]. Food Chemistry, 2012,130(4): 821-825. DOI:10.1016/j.foodchem.2011.07.064.

[16] HARSHA P S C S, GARDANA C, SIMONETTI P, et al.Characterization of phenolics, in vitro reducing capacity and antiglycation activity of red grape skins recovered from winemaking by-products[J]. Bioresource Technology, 2013, 140(7): 263-268.DOI:10.1016/j.biortech.2013.04.092.

[17] POKKAEW R, WANG S H, LIU C D, et al. Properties and characterization of antioxidant and antiglycative activities for the multiple harvests of aquatic- and field-cultivated peanut leaves and stems[J]. Journal of Functional Foods, 2013, 5(1): 327-336.DOI:10.1016/j.jあ.2012.11.003.

[18] 楊喆, 萬(wàn)山, 張喬會(huì), 等. 大孔樹(shù)脂純化山杏核殼總黃酮的工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(10): 38-42. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201510008.

[19] 楊芙蓮, 夏銀, 任蓓蕾. 大孔樹(shù)脂對(duì)甜蕎麥殼類(lèi)黃酮的純化研究[J]. 食品科技, 2009, 34(1): 135-139. DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2009.01.006.

[20] 陳晶, 李琪, 黃春萍, 等. 枇杷花總黃酮、總?cè)频拇罂讟?shù)脂制備工藝[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(18): 58-63. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201518010.

[21] 朱麗艷, 郭蘭, 王瑞雪, 等. 蕎麥花總黃酮和槲皮素對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2010, 21(5): 1135-1136. DOI:10.3969/j.issn.1008-0805.2010.05.051.

[22] 李艷琴, 周鳳超, 陜方, 等. 蕎麥麩皮提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(17): 10-13.

[23] 王娟, 覃景芳, 柳春艷, 等. 小葉薜荔根莖提取物抗α-葡萄糖苷酶及乙酰膽堿酯酶活性研究[J]. 廣西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2017,35(1): 69-74. DOI:10.16088/j.issn.1001-6600.2017.01.012.

[24] 張海鳳, 董亞琳, 胡薩薩, 等. 五種中藥對(duì)兩種不同來(lái)源α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用比較[J]. 中藥材, 2008, 31(7): 1024-1027.DOI:10.3321/j.issn:1001-4454.2008.07.028.

[25] 李楠, 許文鳳, 葉振南, 等. 9 種植物粗提總黃酮的體外降脂及抑制非酶糖基化的活性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 42(6): 291-293.DOI:10.3969/j.issn.1002-1302.2014.06.104.

[26] 房紅娟, 李紅姣, 張雙鳳, 等. 加工條件對(duì)BSA-Glucose模擬體系中晚期糖基化末端產(chǎn)物形成的影響[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(21): 6-10.

[27] 鄧榮華, 陸敏, 夏秋琴, 等. 蘆蒿秸稈黃酮類(lèi)化合物對(duì)晚期蛋白質(zhì)糖基化終末產(chǎn)物形成的抑制作用[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(9): 123-127.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201409025.

[28] 牛鳳玲, 儲(chǔ)金秀, 韓淑英. 蕎麥花總黃酮對(duì)體內(nèi)外蛋白質(zhì)非酶糖基化的抑制作用[J]. 中國(guó)臨床康復(fù), 2006, 10(43): 210-213.

[29] 李曉明, 鄧榮華, 孔陽(yáng)輝, 等. 蘆丁抑制牛血清白蛋白糖基化[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(3): 85-89. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201403018.[30] 陸敏, 李曉明, 盧永翎, 等. 槲皮素抑制蛋白糖基化及DNA損傷[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(1): 104-108. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601019.

[31] NAKAYAMA S, WATADA H. The impact of strict glycemiccontrol on diabetic microangiopathy[J]. Nihon Rinsho, 2010, 68(9): 131-136.

[32] GOLDIN A, BECKMAN J A, SCHMIDT A M, et al. Advanced glycation end products sparking the development of diabetic vascular injury[J]. Circulation, 2006, 114: 597-605.

[33] STEINHART H. The Maillard reaction: chemistry, biochemistry and implications[J]. Australian Journal of Chemistry, 2005, 58(10): 756-756.

[34] 張雙鳳, 蘇亞儒, 李巨秀. 膳食中晚期糖基化終產(chǎn)物對(duì)大鼠腎臟的影響[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(21): 315-320. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201321063.

[35] 劉洋, 柳春, 近藤隆一郎, 等. 苦蕎麥對(duì)糖尿病大鼠血糖蛋白非酶糖基化反應(yīng)的影響[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 11(5): 195-197.DOI:10.13194/j.jlunivtcm.2009.05.197.liuy.094.

[36] 葉曉珂, 秦沛, 李偉, 等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分離鑒定樹(shù)莓葉中黃酮類(lèi)化合物[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào), 2011, 32(5): 271-277.

[37] 吳燕紅, 萬(wàn)林春, 吳良發(fā), 等. 乳塊消顆粒中極性和疏水性成分的LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定[J]. 藥物分析雜志, 2016, 36(8): 1385-1391.DOI:10.16155/j.0254-1793.2016.08.10.

[38] 楊云舒, 李榮, 姜子濤, 等. 月桂葉中黃酮類(lèi)成分的分析鑒定[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2016, 32(7): 270-275. DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.7.041.

[39] 覃小麗, 孫慧園, 楊武, 等. UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS分析槲皮苷在大鼠腸道菌群中的代謝[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2017, 42(2): 357-362.DOI:10.19540/j.cnki.cjcmm.20161222.018.