羅 磊，王雅琪，馬麗蘋，朱文學(xué)*，張 寬，姬青華，關(guān)寧寧，薛依涵

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南省食品原料工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471023）

綠豆（Phaseolus radiatus L.）在我國有兩千多年的栽培歷史，有清涼解毒、止瀉利尿、消熱解暑等功效。綠豆皮是指泡發(fā)綠豆后揉搓下來的種皮，中醫(yī)稱為綠豆衣，有報道指出綠豆的食療保健功能主要來自其種皮[1]，但目前綠豆皮多作為廢渣或飼料，而未被充分利用。綠豆皮中富含膳食纖維（dietary fiber，DF）、黃酮和生物堿等生物活性物質(zhì)，其中DF含量高達(dá)65.85%[2]，有研究人員對綠豆皮中DF的提取[3]及結(jié)構(gòu)[4]進(jìn)行了研究。袁艷娟等[5]發(fā)現(xiàn)綠豆皮DF有較好的持水力和溶脹力；王倩等[6]研究了綠豆皮不溶性DF的提取及理化性質(zhì)。而迄今為止，國內(nèi)外對綠豆皮DF尤其是可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）功能性質(zhì)方面的研究鮮見報道。

機體在代謝的過程中會產(chǎn)生大量的氧自由基，包括過氧化氫、羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）等[7]，這些自由基使多種生物大分子氧化損傷，對基因的表達(dá)和調(diào)節(jié)系統(tǒng)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平降低而引起衰老甚至造成免疫失調(diào)。因此，研究如何有效清除或抑制自由基的產(chǎn)生對延緩衰老和預(yù)防疾病有重要的意義。Zhu Fengmei等[8]指出青稞麩皮DF具有抗氧化活性；王磊等[9]發(fā)現(xiàn)椪柑渣中SDF對·OH、O2-·和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）自由基均表現(xiàn)出較強清除能力；另外，豆渣[10]和米糠[11]SDF的體外抗氧化活性均已得到證實，而針對綠豆皮中SDF抗氧化作用的研究鮮有報道。故本研究在對綠豆皮SDF體外清除自由基能力研究的同時，采用皮下注射D-半乳糖的方法誘導(dǎo)小鼠衰老模型[12]來研究綠豆皮SDF在體內(nèi)的抗氧化作用，為綠豆皮SDF開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆皮由洛陽新農(nóng)村豆芽廠提供。

SPF級BALB/c小鼠共50 只，鼠齡8周，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半，由河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心從華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心代購，許可證號：SCXK-（鄂）2010-0009。

DPPH 上海伊卡生物技術(shù)有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）測定試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、總蛋白含量測定（二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法）試劑盒 南京建成生物工程研究所；冰醋酸、醋酸鈉、無水乙醇、VC、三氯乙酸、氯化鐵、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、過氧化氫、水楊酸、D-半乳糖、氯化鈉等常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HC-1000Y2高速多功能粉碎機 永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司；HMB-701超微粉碎機 北京環(huán)亞天元機械技術(shù)有限公司；TDZ5-WS臺式低速離心機、TGL-20M高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；PHS-3C pH計 上海越平科學(xué)儀器有限公司；101-2-BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；UV2400紫外-可見分光光度計 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；HH-S恒溫水浴鍋 江蘇金壇市億通電子有限公司；FA1004型電子分析天平 上海上平儀器公司；電子天平 常熟市金羊砝碼儀器有限公司；微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；玻璃勻漿器 江陰市精英玻璃制品廠。

1.3 方法

1.3.1 綠豆皮SDF的制備

綠豆皮經(jīng)蒸餾水反復(fù)清洗、除雜后，在室溫下干燥至恒質(zhì)量，后經(jīng)高速粉碎機粉碎后過50 目篩，得到綠豆皮粗粉，然后放入超微粉碎機（1.5 kW）中粉碎，過400 目篩得到綠豆皮超微粉（此時樣品通過400 目篩而未通過500 目篩，粒徑為38～25 μm）。根據(jù)GB 5009.88—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中膳食纖維的測定》[13]進(jìn)行綠豆皮SDF制備，所得綠豆皮SDF固體放在40 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥，稱質(zhì)量，得到綠豆皮SDF得率為9.52%，略高于李積華[14]采用改良的Southgate法測定綠豆皮SDF的含量（9.063%）。

1.3.2 綠豆皮SDF體外抗氧化作用1.3.2.1 還原力的測定

采用鐵氰化鉀法[15]進(jìn)行還原力的測定。用移液槍量取0.4 mL不同質(zhì)量濃度（0.062 5～4.000 0 mg/mL）的樣品溶液，加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）和2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后在50 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min，快速置于冰水中冷卻。再加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液，混勻，3 000 r/min離心10 min。取上清液，加入2.5 mL蒸餾水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的FeCl3溶液0.5 mL，混勻后靜置10 min，在700 nm波長處測定其吸光度。用蒸餾水代替樣品做相同操作并以此為空白對照，VC作為陽性對照，做3 次平行實驗。

1.3.2.2 DPPH自由基清除率計算

參考朱文學(xué)等[16]的方法，并稍作改動，配制不同質(zhì)量濃度（0.062 5～4.000 0 mg/mL）的綠豆皮SDF溶液，用蒸餾水作為空白對照，在517 nm波長處檢測吸光度。以VC作為陽性對照，重復(fù)3 組取平均值。按式（1）計算DPPH自由基清除率。

式中：Ai為DPPH溶液和不同質(zhì)量濃度的樣品或VC混合溶液的吸光度；Aj為無水乙醇和不同質(zhì)量濃度的樣品或VC混合溶液吸光度；Ac為DPPH溶液和蒸餾水混合溶液的吸光度。

1.3.2.3 ·OH清除率計算

參考Lai Furao等[17]的方法，并稍作改動，配制不同質(zhì)量濃度（0.062 5～4.000 0 mg/mL）的綠豆皮SDF溶液，用蒸餾水作為空白對照，在510 nm波長處檢測吸光度。以VC作為陽性對照，設(shè)3 組平行，取平均值。按式（2）計算·OH清除率。

式中：A1為FeSO4溶液、不同質(zhì)量濃度的樣品或VC溶液、30% H2O2溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、水楊酸混合溶液的吸光度；A2為FeSO4溶液、不同質(zhì)量濃度的樣品或VC溶液、30% H2O2溶液、無水乙醇混合溶液的吸光度；A0為FeSO4溶液、蒸餾水、30% H2O2溶液、水楊酸混合溶液的吸光度。

1.3.3 綠豆皮SDF對小鼠體內(nèi)抗氧化作用

1.3.3.1 動物分組、造模與給藥

實驗期間，50 只小鼠分籠飼喂普通飼料，自由攝食和飲水，適應(yīng)性培養(yǎng)1 周后隨機分為5 組：正常對照組、模型組、綠豆皮SDF低劑量組（200 μg/g）、中劑量組（400 μg/g）、高劑量組（600 μg/g），每組10 只，雌雄各半，模型組和綠豆皮SDF各劑量組小鼠頸背部皮下注射D-半乳糖（200 mg/kg體質(zhì)量）構(gòu)建衰老小鼠模型，正常對照組注射等體積的生理鹽水。每日給藥1 次，連續(xù)給藥30 d，綠豆皮SDF各劑量組灌胃綠豆皮SDF溶液，灌胃體積為20 mL/kg體質(zhì)量[18]，正常對照組和模型組灌胃等體積的生理鹽水。

1.3.3.2 小鼠血清及肝組織樣品制備

給藥第30天小鼠空腹過夜，各組小鼠稱體質(zhì)量后眼眶采血，4 ℃、3 000 r/min離心15 min分離血清，取上清液，-20 ℃保存待測。小鼠取血后頸椎脫臼處死，快速取出肝臟，以冰生理鹽水洗去浮血，濾紙吸干，迅速稱質(zhì)量。加入9 倍組織質(zhì)量的已預(yù)冷生理鹽水（9 mg/mL），冰水浴條件下用玻璃勻漿器迅速研磨勻漿，4 ℃、3 500 r/min離心15 min，取上清液，-20 ℃保存待測。

1.3.3.3 檢測指標(biāo)測定

按照相應(yīng)試劑盒說明書分別對小鼠血清和肝組織總蛋白含量（BCA法）、T-AOC水平、CAT和T-SOD活力、MDA含量以及小鼠肝組織GSH-Px活力進(jìn)行測定。T-AOC測定采用Fe3＋還原法，CAT活力測定采用鉬酸銨比色法，T-SOD活力通過黃嘌呤氧化酶法測定，MDA含量通過硫代巴比妥酸比色法進(jìn)行測定，GSH-Px活力測定采用二硫?qū)ο趸郊姿岱ā?/p>

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抗氧化作用

2.1.1 還原力測定結(jié)果

圖1 綠豆皮SDF還原力Fig. 1 Reducing power of SDF from mung bean hull

吸光度越高，還原力越強。由圖1可以看出，VC的還原力在質(zhì)量濃度為250 μg/mL時已達(dá)到了2.063，之后無明顯變化。而綠豆皮SDF的還原力在0.062 5～4.000 0 mg/mL范圍內(nèi)隨著質(zhì)量濃度的增加而增大，當(dāng)質(zhì)量濃度為4 mg/mL時，還原力為1.526。在所考察的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，綠豆皮SDF的還原力不如VC。但與唐孝青等[19]通過浸提法得到梨渣SDF在質(zhì)量濃度為4 mg/mL時的還原力0.845相比，綠豆皮SDF的還原力較強。

2.1.2 DPPH自由基清除效果

圖2 綠豆皮SDF對DPPH自由基的清除作用Fig. 2 Scavenging effect of SDF from mung bean hull against DPPH radicals

由圖2可知，V C對D P P H自由基的清除率在250 μg/mL時為99.32%，隨著質(zhì)量濃度的增大其清除率逐漸趨于100%。綠豆皮SDF對DPPH自由基的清除能力呈現(xiàn)出劑量依賴性。當(dāng)質(zhì)量濃度為62.5 μg/mL和4 mg/mL時，其清除率分別為21.81%和82.65%。Yan Xiaoguang等[20]通過蒸汽爆破處理小麥麩皮后制備的SDF在5 mg/mL時對DPPH的清除率為87.15%，因此綠豆皮SDF表現(xiàn)出較強的DPPH自由基的清除能力。

2.1.3 ·OH清除效果

圖3 綠豆皮SDF對?OH的清除作用Fig. 3 Scavenging effect of SDF from mung bean hull against hydroxyl radicals

綠豆皮SDF對·OH清除能力結(jié)果如圖3所示，在質(zhì)量濃度為0.062 5～4.000 0 mg/mL范圍內(nèi)其清除率與質(zhì)量濃度有明顯的量效關(guān)系。隨著SDF質(zhì)量濃度的增大，綠豆皮SDF的·OH清除率也逐漸增大，從62.5 μg/mL時的17.45%到4 mg/mL時的85.16%，而VC的·OH清除率在500 μg/mL時已幾乎達(dá)到了100%。高辰等[21]利用噴霧劑壓結(jié)合酶對豆渣SDF進(jìn)行提取并得出豆渣SDF在4 mg/mL時對·OH清除率為80%左右，進(jìn)一步證實綠豆皮SDF具有較強清除·OH能力。

2.2 綠豆皮SDF對小鼠的抗氧化作用

2.2.1 綠豆皮SDF對小鼠血清和肝組織中T-AOC水平的影響

表1 綠豆皮SDF對小鼠血清和肝組織中T-AOC水平的影響Table 1 Effect of SDF from mung bean hull on T-AOC in serum and liver tissue of mice

綠豆皮SDF對小鼠T-AOC水平的影響如表1所示，模型組小鼠肝組織和血清T-AOC水平均極顯著低于正常對照組（P＜0.01），血清中SDF低、中劑量組也極顯著低于正常組，肝組織中只有SDF低劑量組極顯著低于正常組；與模型組相比，除SDF低劑量組小鼠血清T-AOC水平低于其模型組外，其余小鼠肝組織和血清中各劑量組T-AOC水平均極顯著高于模型組，說明中、高劑量的SDF能有效提高小鼠體內(nèi)T-AOC水平。

2.2.2 綠豆皮SDF對小鼠血清和肝組織中T-SOD活力的影響

表2 綠豆皮SDF對小鼠血清和肝組織中T-SOD活力的影響Table 2 Effect of SDF from mung bean hull on T-SOD in serum and liver tissue of mice

由表2可知，模型組小鼠肝組織和血清T-SOD活力均極顯著低于正常對照組（P＜0.01）；與模型組相比，小鼠SDF低、中劑量組肝組織中T-SOD活力降低，但差異不顯著（P＞0.05），其余小鼠血清、肝組織中SDF各劑量組T-SOD活力均提高，其中小鼠SDF各劑量組血清中T-SOD活力與模型組差異極顯著（P＜0.01），小鼠SDF高劑量組肝組織中T-SOD活力與模型組差異顯著（P＜0.05）。

2.2.3 綠豆皮SDF對小鼠血清和肝組織中CAT活力的影響

表3 綠豆皮SDF對小鼠血清和肝組織中CAT活力的影響Table 3 Effect of SDF from mung bean hull on CAT activity in serum and liver tissue of mice

表3表明，模型組和SDF低劑量組小鼠肝組織和血清CAT活力均極顯著低于正常對照組（P＜0.01）；小鼠SDF各劑量組與模型組相比CAT活力均有一定的升高，除小鼠血清SDF高劑量組具顯著性（P＜0.05）外，其他各組小鼠SDF各劑量組與模型組無顯著差異（P＞0.05）。

2.2.4 綠豆皮SDF對小鼠血清和肝組織中MDA含量的影響

表4 綠豆皮SDF對小鼠血清和肝組織中MDA含量的影響Table 4 Effect of SDF from mung bean hull on MDA content in serumand liver tissue of mice

從表4可以看出，與正常對照組相比，模型組小鼠肝組織和血清MDA含量均極顯著增加（P＜0.01），SDF低、中劑量組小鼠肝組織中MDA含量升高且有極顯著、顯著差異；SDF各劑量組小鼠血清MDA含量較模型組均極顯著或顯著減少。

2.2.5 綠豆皮SDF對小鼠肝組織中GSH-Px活力的影響

表5 綠豆皮SDF對小鼠肝組織中GSH-Px活力的影響Table 5 Effect of SDF from mung bean hull on GSH-Px activity in liver tissue of mice

由表5可知，與正常對照組相比，模型組小鼠肝組織中GSH-Px活力均有所降低，但都不具顯著性差異（P＞0.05），小鼠SDF高劑量組GSH-Px活力較模型組差異顯著（P＜0.05）。

2.2.6 模型分析與討論

皮下注射大劑量的D-半乳糖使機體細(xì)胞內(nèi)半乳糖質(zhì)量濃度增高，在醛糖還原酶的催化下生成半乳糖醇，這種物質(zhì)不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝并不斷堆積，從而影響細(xì)胞滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、功能喪失和代謝紊亂，最終導(dǎo)致衰老的發(fā)生[22-23]。機體通過酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，酶系統(tǒng)中最主要的抗氧化酶T-SOD能夠催化O2-·發(fā)生歧化反應(yīng)[24]，并能有效地清除自由基反應(yīng)的啟動因子（O2-·）來抑制和阻斷自由基反應(yīng)，降低自由基代謝產(chǎn)物（如MDA）的生成，從而達(dá)到清除自由基、抗衰老的作用[25]；CAT雖然不能直接清除·OH，但其可以分解體內(nèi)·OH的前體過氧化氫，生成對人體無害的水來降低過氧化氫的濃度[26]，從而起到延緩衰老的作用；GSH-Px是一種重要的催化過氧化氫分解的酶，對活性氧和組織產(chǎn)生的·OH及過氧化氫有較強的清除能力[27]，GSH-Px通過硒代半胱氨酸的形式發(fā)揮作用，以谷胱甘肽為還原劑來分解體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物，因此它可以使細(xì)胞膜與其他生物組織免受過氧化損傷[28]，GSH-Px也可與CAT協(xié)同作用，加速過氧化氫的分解來達(dá)到減少自由基和過氧化脂質(zhì)形成的作用[29]；非酶系統(tǒng)中MDA能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用形成脂質(zhì)過氧化物。氧自由基不但通過生物膜中多不飽和脂肪酸的過氧化引起細(xì)胞損傷，還能通過脂類過氧化物的分解產(chǎn)物引起細(xì)胞損傷，因此MDA含量可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出細(xì)胞損傷即機體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[30]。

本研究通過D-半乳糖皮下注射（200 mg/kg）構(gòu)建衰老動物模型來評估綠豆皮SDF粗提物的抗氧化活性。結(jié)果顯示與正常對照組相比，模型組小鼠血清和肝組織中總蛋白含量、T-AOC水平以及T-SOD、CAT、GSH-Px活力均有所降低，MDA含量大幅升高，且大部分差異顯著或極顯著，因此說明本研究衰老動物模型構(gòu)建基本成功。

在衰老模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行綠豆皮SDF各劑量組對小鼠血清及肝組織的抗氧化能力影響的研究。綜合表1～5分析，與模型組比較，SDF各劑量組不同性別小鼠血清和肝組織中MDA含量表現(xiàn)出不同程度的降低，SDF低、中、高劑量組小鼠血清MDA含量分別降低了23.0%、25.5%、30.0%，肝組織中分別降低了14.4%、26.0%、48.3%，這可能是由于綠豆皮SDF能夠穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、抑制脂質(zhì)過氧化從而有效地降低小鼠體內(nèi)MDA含量。灌胃一定劑量的綠豆皮SDF后，小鼠低劑量組血清T-AOC水平、肝組織T-SOD活力及中劑量組肝組織T-SOD活力低于模型組，但均無顯著差異，這可能是由于低劑量的SDF對機體抗氧化作用不明顯且小鼠之間存在較大個體差異。隨著綠豆皮SDF劑量不斷增加，高SDF劑量組小鼠血清和肝組織T-AOC水平以及T-SOD、CAT、GSH-Px活力均顯著高于模型組，其中高劑量組小鼠血清T-AOC水平以及T-SOD、CAT活力分別提高了121%、63.3%、59.7%，而肝組織中血清T-AOC水平、T-SOD、CAT活力以及GSH-Px活力較模型組相比分別提高了104%、18.0%、63.0%、45.0%。同時，各劑量組小鼠血清和肝組織中T-AOC水平以及T-SOD、CAT、GSH-Px活力呈現(xiàn)出劑量相關(guān)性。由此可以看出，綠豆皮SDF尤其是高劑量的SDF具有一定的提高D-半乳糖衰老模型小鼠血清和肝組織中T-AOC水平以及T-SOD、CAT、GSH-Px活力和降低MDA含量的作用。

3 結(jié) 論

體外抗氧化實驗表明，綠豆皮SDF在質(zhì)量濃度為4 mg/mL時，還原力為1.526，對DPPH自由基和·OH均表現(xiàn)出較強的清除率，分別為82.65%和85.16%。體內(nèi)抗氧化實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，不同性別模型組小鼠血清和肝組織中總蛋白含量、T-AOC水平以及T-SOD、CAT、GSH-Px活力均有所降低，MDA含量大幅升高，且大部分差異顯著（P＜0.05），說明本研究衰老動物模型構(gòu)建基本成功；與模型組相比，各劑量組小鼠血清和肝組織中總蛋白含量、T-AOC水平以及T-SOD、CAT、GSH-Px活力呈現(xiàn)出劑量相關(guān)性。結(jié)果表明綠豆皮SDF能有效提高小鼠血清和肝組織中總蛋白含量、降低MDA含量，高劑量SDF可顯著提高小鼠血清和肝組織T-AOC水平以及T-SOD、CAT、GSH-Px活力。

綜上所述，綠豆皮SDF具有較強的清除自由基的能力，一定量的綠豆皮SDF能夠有效增強機體清除自由基的能力，因此綠豆皮SDF具有良好的抗氧化和延緩衰老的作用。

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