韓麗榮，魏碩名，王旭鋒，王春玲*

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是n-3系多不飽和脂肪酸[1]，目前主要的來源是深海魚油[2]。DHA純品是一種無色無味的脂溶性液體，低溫下具有較高的流動性[3]。研究表明，DHA具有多種生理功能，如預防腦血栓[4]、促進嬰幼兒的大腦發(fā)育[5-6]、抗炎[7]和抗癌[8]等。自研究證實了DHA的抗癌功能[9-10]，對于DHA其他的生物學功能也引起了人們的極大關注。

DHA是一種人體必需的脂肪酸[11]，人體無法自身合成，因此，DHA的生理功能成為了當前的研究重點。在《美國高血壓》雜志上，澳大利亞西澳大學科學家Moili等[12]指出，DHA能使血液中膽固醇水平和血液黏稠度降低，使人體內(nèi)脂蛋白和血脂代謝得到調(diào)節(jié)，達到降血壓的目的。Calviello等[13]發(fā)現(xiàn)，DHA與5-氟尿嘧啶同時使用，能夠抑制結(jié)腸癌細胞的生長，誘導癌細胞的凋亡。尤麗菊等[14]在DHA的藥理作用中提到，DHA含量增加，花生四烯酸含量降低，丙二醛生成減少，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性增加。賀敏等[15]證實了高含量二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）/DHA甘油三酯型可顯著改善免疫低下模型小鼠的免疫調(diào)節(jié)功能，其免疫調(diào)節(jié)作用可能與其甘油三酯含量及EPA/DHA含量相關。但目前關于DHA免疫功能方面的研究主要是從動物實驗方面，而且僅對其免疫調(diào)節(jié)活性進行了初步探討。

以小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞為研究對象，采用噻唑藍（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）法、細胞染色法、相關酶活力的測定以及關鍵蛋白酶等方法，研究DHA的免疫調(diào)節(jié)活性，這將為DHA在食品和保健品中的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RAW264.7細胞株 中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。

DHA標準品 美國Sigma公司；MTT、吖啶橙（acridine orange，AO）染液、高效蛋白裂解液（radio immunoprecipitation assay，RIPA） 北京索萊寶科技有限公司；中性紅 天津市天新精細化工開發(fā)中心；糖原過碘酸希夫反應（periodic acid Schiff reaction，PAS）染色液 北京雷根生物技術有限公司；酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）試劑盒、溶菌酶（lysozyme，LSZ）試劑盒、SOD試劑盒 南京建成生物工程研究所；pho-ERK1/2抗體、ERK1/2抗體、pho-JNK/SAPK抗體、JNK/SAPK抗體、pho-p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPKs） 抗體、p38 MAPKs抗體、辣根過氧化物標記IgG（H＋L）抗體 碧云天生物技術公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；紫外-可見分光光度儀、Multiskan GO酶標儀、3110二氧化碳培養(yǎng)箱 賽默飛世爾科技公司；SU1510掃描電子顯微鏡 日本日立集團有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

細胞培養(yǎng)液：RPMI-1640培養(yǎng)液與胎牛血清的比例為9∶1（V/V），必要時可加入0.1%青鏈霉素混合雙抗，4 ℃保存。

細胞凍存液：20%胎牛血清，70% RPMI-1640培養(yǎng)液，10%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），現(xiàn)用現(xiàn)配。

MTT溶液配制：精確稱取MTT 50 mg溶于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）緩沖液（pH 7.2），終質(zhì)量濃度為5 mg/mL，0.22 μm水系濾膜過濾除菌，4 ℃避光保存。

中性紅溶液配制：用0.9%的生理鹽水使中性紅濃度為0.1%，0.22 μm水系濾膜過濾除菌，4 ℃避光保存。

DHA母液配制：將DHA標準品溶于DMSO中，配制成5 mg/mL的DHA溶液，-20 ℃避光保存，現(xiàn)稀釋現(xiàn)用。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）緩沖液（10×）：Tris 7.5 g、甘氨酸36.0 g、SDS 5.0 g，三蒸水定容至500 mL，4 ℃貯存，用時稀釋10 倍。

SDS凝膠上樣緩沖液（5×）：100 mmol/L Tris-HCl（pH 6.8）1.2 mL、10% SDS 4 mL、0.1%溴酚藍0.01 mL、20%甘油2 mL、三蒸水2.8 mL。

0.025 mol/L轉(zhuǎn)移電泳緩沖液（5×）：Tris 18.925 g、甘氨酸96.5 g，三蒸水定容至1 000 mL，4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

洗滌緩沖液（Tris-buffered saline Tween 20，TBST）：Tris 4.84 g、NaCl 58.48 g，加三蒸水至2 000 mL，臨用前加入0.5 mL Tween 20，pH 7.5。

1.3.2 DHA增殖和吞噬活性實驗

1.3.2.1 DHA對RAW264.7增殖活性的影響

采用MTT法[16]測定DHA對RAW264.7細胞增殖活性的影響，DHA作用RAW264.7細胞一定時間后，使用酶標儀測定各孔570 nm波長處的吸光度。以不加DHA的為空白對照組。采用5 μg/mL的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）處理細胞，作為陽性對照組。細胞增殖率根據(jù)下式計算。

1.3.2.2 DHA對RAW264.7吞噬活性的影響

采用中性紅實驗測定DHA對RAW264.7吞噬活性的影響，巨噬細胞所具有的吞噬活性，能將大分子的中性紅內(nèi)吞入細胞，當用細胞裂解液裂解細胞后，細胞內(nèi)的中性紅溶出，被吞噬的中性紅的量與540 nm波長處的吸光度成正比，因此可用此吸光值衡量巨噬細胞的吞噬能力。DHA作用細胞一定時間后，使用酶標儀測定處各孔A540nm。

1.3.3 DHA對RAW264.7細胞形態(tài)的影響

1.3.3.1 掃描電子顯微鏡觀察

細胞培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS洗去殘留培養(yǎng)液，以2.5%戊二醛溶液固定細胞2 h，依次以不同體積分數(shù)（10%、30%、50%、70%、90%、90%、100%）的乙醇對細胞進行脫水處理。取出蓋玻片，剪成適量大小粘于樣品臺，噴金后進行電子顯微鏡掃描，觀察經(jīng)DHA作用后RAW264.7細胞的形態(tài)變化。

1.3.3.2 AO染色

細胞培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS洗去殘留培養(yǎng)液，細胞固定液（乙醇-冰醋酸-氯仿（6∶1∶3，V/V））固定細胞10 min，加入以1%乙酸溶液酸化后棄去液體，避光條件下加入0.01% AO染液染色20 min，以0.1 mol/L氯化鈣溶液分色1 min，PBS洗去殘留液。取出蓋玻片，置于潔凈載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3.3.3 糖原PAS染色

細胞培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS洗去殘留培養(yǎng)液，用10%福爾馬林固定細胞30 min，加入過碘酸溶液室溫氧化5～8 min，流水沖洗蓋玻片后用蒸餾水浸洗，加入Schiff試劑室溫避光染色20 min，流水沖洗10 min。取出蓋玻片，置于潔凈載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3.4 DHA對RAW264.7細胞酶活性的影響

取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞進行計數(shù)，調(diào)整細胞懸液密度為1×104個/mL，以4 mL/瓶加入細胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過夜，使細胞充分貼壁。棄去培養(yǎng)液，空白對照組只加入培養(yǎng)液，實驗組加入分別含有400、600、800、1000 ng/mL DHA的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h。細胞經(jīng)胰酶消化、PBS清洗后離心收集，分別測定細胞ACP、LSZ和SOD的活力。

1.3.4.1 ACP活力測定

將細胞重懸于500 μL蒸餾水中，超聲破碎1 min，2 500 r/min離心10 min。用BCA蛋白測定試劑盒測定上清液蛋白含量，樣品按照ACP測定試劑盒說明書操作，計算細胞中ACP的活力。

1.3.4.2 LSZ活力測定

將細胞重懸于500 μL PBS中，調(diào)整細胞懸液密度為1×106mL－1，超聲破碎1 min，2 500 r/min離心10 min。樣品按照溶菌酶測定試劑盒說明書操作，并計算細胞中LSZ的活力。

1.3.4.3 SOD活力測定

將細胞重懸于500 μL蒸餾水中，超聲破碎1 min，2 500 r/min離心10 min。用BCA蛋白測定試劑盒測定上清液蛋白含量，樣品按照SOD測定試劑盒說明書進行操作，并計算細胞中SOD的活力。

1.3.5 MAPKs蛋白激酶家族蛋白表達量的測定

采用Western Blot法測定RAW264.7細胞內(nèi)MAPKs家族蛋白的表達量。

1.3.5.1 蛋白樣品的制備

培養(yǎng)RAW264.7至充分貼壁后，吸出培養(yǎng)液，換為含DHA（0、600、800、1 000 ng/mL）的RPMI-1640培養(yǎng)液。

培養(yǎng)結(jié)束，收集細胞并重懸于Hanks緩沖液中，1 000 r/min離心5 min，移棄管內(nèi)液體，重復漂洗2 次。

每管細胞中按照100:1的比例加入RIPA和蛋白酶抑制劑（phenylmethanesulfonyl ぼuoride，PMSF），冰浴中振蕩0.5 h。

轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，4 ℃、12 000 r/m離心20 min，吸取上清液蛋白提取液。

BCA蛋白法測定蛋白濃度，加入適量上樣緩沖液，100 ℃煮沸3～5 min使蛋白變性，10 000 r/min離心5 min后即可上樣，上樣量為10～40 μL/孔（上樣蛋白質(zhì)量不低于50 μg）。

1.3.5.2 SDS-PAGE

按實驗所需檢測的蛋白分子質(zhì)量，配制12%分離膠及5%濃縮膠。電泳時濃縮膠施加80 V電壓，待溴酚藍染料至下層分離膠處，電壓調(diào)至120 V，直至溴酚藍染料接近膠體底部，此過程大約需要1.5～2.0 h。

轉(zhuǎn)移電泳：將濾紙和NC膜裁剪成與電泳凝膠相同大小，用預冷并加入甲醇的轉(zhuǎn)移電泳緩沖液平衡約15 min。電轉(zhuǎn)前，利用NC膜、濾紙及分離膠膠制作“三明治”結(jié)構(gòu)：首先，剝棄濃縮膠，將剝離下來的分離膠蓋于已平衡的三層濾紙上，安裝電泳轉(zhuǎn)移槽，300 mA轉(zhuǎn)移1.5～2.0 h。

雜交：脫脂奶粉溶液封閉膜、T B S T溶液洗膜、一抗4 ℃孵育過夜、TBST溶液洗膜、二抗室溫孵育1 h、TBST溶液洗膜、免疫印跡化學發(fā)光液（electrochemiluminescence reagent，ECL）顯色NC膜、顯影液顯影、定影液定影，并拍照記錄數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 DHA增殖和吞噬活性實驗結(jié)果

2.1.1 DHA對RAW264.7增殖活性的影響

巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，具有多種免疫功能，如吞噬外來的小顆粒物質(zhì)、呈遞抗原、分泌細胞因子等。一般情況下巨噬細胞處于休眠狀態(tài)，吞噬能力很弱，當受到一些免疫增強劑激活以后，巨噬細胞表現(xiàn)出更強增殖、吞噬及胞飲能力[17]。

圖1 DHA作用質(zhì)量濃度對RAW264.7細胞增殖率的影響Fig. 1 Effect of DHA concentration on proliferation index of RAW264.7 cells

由圖1可知，不同質(zhì)量濃度的DHA與細胞共培養(yǎng)24 h后細胞的增殖能力均有所增加，但其對應質(zhì)量濃度的增殖能力均小于共培養(yǎng)48 h后的增殖能力。陽性對照組中，經(jīng)過LPS處理細胞后，細胞增殖能力增加最顯著，說明RAW264.7細胞處于正?？杀患せ畹臓顟B(tài)。共同培養(yǎng)48 h后的細胞，在給藥800 ng/mL時，增殖能力達到頂峰，細胞增殖率為73.03%；在1 000 ng/mL時，細胞增殖能力有所下降，但同空白對照組相比，細胞仍表現(xiàn)為增殖作用。共培養(yǎng)72 h后的細胞，由于細胞營養(yǎng)條件的限制，隨著作用劑量的增加，細胞數(shù)量增幅較小。

MTT實驗結(jié)果表明，在實驗范圍內(nèi)，DHA與RAW264.7細胞的最佳作用時間為48 h，最佳作用劑量為800 ng/mL，因此后續(xù)實驗選定DHA的作用時間為48 h。

2.1.2 DHA對RAW264.7吞噬活性的影響

通過對DHA作用后RAW264.7細胞吞噬中性紅能力的測定，判斷DHA對RAW264.7細胞吞噬活性的影響。

圖2 DHA作用質(zhì)量濃度對RAW264.7細胞吞噬活性的影響Fig. 2 Effect of DHA concentration on phagocytic activity of RAW264.7 cells

如圖2所示，當DHA質(zhì)量濃度為800 ng/mL時，RAW264.7細胞吞噬活性最高。中性紅吞噬實驗初步說明DHA能夠激活RAW264.7細胞，通過提高巨噬細胞的吞噬能力來發(fā)揮DHA的免疫活性，執(zhí)行各種免疫防御功能，且在一定的質(zhì)量濃度范圍（0～1 000 ng/mL）內(nèi)，RAW264.7細胞的吞噬活性與DHA具有明顯的劑量依賴關系。

2.2 DHA對RAW264.7細胞形態(tài)的影響

2.2.1 掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

巨噬細胞存在不同的形態(tài)和功能等級，在受到外源因素作用的情況下，巨噬細胞從靜息狀態(tài)變成活化狀態(tài)，細胞形態(tài)及功能會發(fā)生明顯變化。

圖3 DHA作用RAW264.7細胞的掃描電子顯微鏡圖像Fig. 3 SEM images showing the microstructure of RAW264.7 treated with DHA

由圖3可知，以800 ng/mL的DHA作用細胞48 h后，細胞體積增大，表面突起明顯，貼壁面積明顯增大，褶皺增加，并有部分偽足出現(xiàn)；而空白對照未經(jīng)激活的細胞體積較小，形狀規(guī)則，細胞表面突起較小。以上結(jié)果表明RAW264.7細胞在800 ng/mL的DHA作用下，外部形態(tài)已呈現(xiàn)明顯的活化特征。

2.2.2 AO染色結(jié)果

采用AO染色觀察經(jīng)DHA作用后，RAW264.7細胞內(nèi)DNA和RNA代謝情況。AO是一種能和細胞中的核酸相結(jié)合并產(chǎn)生特異性熒光的染料[18]，能與細胞核內(nèi)的DNA和RNA結(jié)合，呈綠色熒光。

圖4 DHA作用RAW264.7細胞的AO染色圖（×400）Fig. 4 AO staining of RAW264.7 treated with DHA (× 400)

圖4表明，對照組細胞處于靜息狀態(tài)，細胞呈圓形，形狀規(guī)則、大小均勻、體積較小，DHA作用組細胞體積變大、數(shù)目增多，細胞核區(qū)的綠色熒光亮度增強，說明在DHA作用下，RAW264.7細胞被激活，細胞核酸代謝旺盛。

2.2.3 糖原PAS染色結(jié)果

圖5 DHA作用RAW264.7細胞的PAS染色圖（×400）Fig. 5 PAS staining of RAW264.7 treated with DHA (× 400)

RAW264.7細胞內(nèi)的糖原變化情況采用Schiff’s法檢測[19]。由圖5可知，細胞質(zhì)中的糖原經(jīng)DHA作用后被染成紫紅色，與對照組細胞相比，DHA作用組細胞的細胞質(zhì)染色加深，細胞總數(shù)明顯增多，細胞形態(tài)進一步分化，不規(guī)則程度加深。當DHA質(zhì)量濃度為600 ng/mL時，細胞內(nèi)糖原被紫紅色濃染，表明細胞內(nèi)糖原代謝加快；當DHA質(zhì)量濃度為800 ng/mL時，視野內(nèi)梭形細胞聚集，細胞數(shù)量進一步增多。以上結(jié)果表明，DHA能通過促進RAW264.7細胞內(nèi)糖原代謝加快細胞的分化。

2.3 DHA對RAW264.7細胞酶活性的影響

2.3.1 DHA對RAW264.7細胞ACP活性的影響

酸性磷酸酶是吞噬細胞殺菌的物質(zhì)基礎，能在第一時間反應巨噬細胞的活化狀態(tài)。酸性磷酸酶形成的水解酶體系通過參與巨噬細胞的多種溶酶體消化功能，能夠破壞和消除侵入機體的異物，達到機體防御的功能[20]。

圖6 DHA質(zhì)量濃度對RAW264.7細胞ACP活性的影響Fig. 6 Effect of DHA concentration on ACP activity in RAW264.7 cells

由圖6可見，與對照組相比，當400 ng/mL DHA作用于RAW264.7細胞48 h后，細胞內(nèi)ACP活力極顯著升高，繼續(xù)增加DHA的質(zhì)量濃度，細胞ACP活力也隨之增強。當DHA質(zhì)量濃度為800 ng/mL時，ACP活力達到最大值123 U/g pro，是對照組酶活力的2.20 倍。以上結(jié)果表明，DHA能促進RAW264.7細胞分泌ACP，提高細胞的吞噬、殺菌能力。

2.3.2 DHA對RAW264.7細胞LSZ活性的影響

溶菌酶又稱胞壁質(zhì)酶，是一種廣泛存在于動植物及微生物中的能水解細菌或真菌的胞壁多糖的堿性蛋白[21]。細菌或真菌的細胞壁經(jīng)溶菌酶水解后，菌體滲透壓失衡發(fā)生破裂，溶菌酶起到了破壞和消除入侵機體異物的作用，擔負著機體的防御功能，溶菌酶活性的強弱也反映了巨噬細胞的活化能力。

圖7 DHA質(zhì)量濃度對RAW264.7細胞LSZ活力的影響Fig. 7 Effect of DHA concentration on LSZ activity in RAW264.7 cells

由圖7可見，與對照組相比，各劑量組RAW264.7細胞的溶菌酶活力極顯著增強，在作用質(zhì)量濃度為400～800 ng/mL的范圍內(nèi)，細胞中溶菌酶的活力隨DHA作用質(zhì)量濃度的增加而增加，呈現(xiàn)明顯的質(zhì)量濃度依賴性，并在800 ng/mL時活力達到最大值。以上結(jié)果表明，DHA能促進RAW264.7細胞產(chǎn)生溶菌酶。

2.3.3 DHA對RAW264.7細胞SOD活性的影響

SOD是細胞內(nèi)存在的一種抗氧化酶，它能催化超氧陰離子發(fā)生反應從而減少其在體內(nèi)的累積，降低對機體的損傷，是自由基清除體系和機體代謝的關鍵酶[22]。

圖8 DHA質(zhì)量濃度對RAW264.7細胞SOD活力的影響Fig. 8 Effect of DHA concentration on SOD activity in RAW264.7 cells

由圖8可見，在實驗劑量下，D H A可以刺激RAW264.7細胞，使細胞SOD活力與對照組相比呈極顯著增強，當質(zhì)量濃度在400～800 ng/mL范圍內(nèi)時，作用效果具有劑量依賴，細胞代謝能力隨著作用劑量的增加逐步提高，細胞處于活化狀態(tài)。

測定經(jīng)不同濃度DHA作用RAW264.7細胞后細胞中酸性磷酸酶、溶菌酶和超氧化物歧化酶的酶活，可知DHA能顯著增加RAW264.7細胞相關酶的分泌及活性、提高細胞殺菌、代謝及抗氧化能力，奠定了巨噬細胞活化的基礎。

2.4 DHA對RAW264.7細胞MAPKs相關蛋白的影響

MAPKs是細胞內(nèi)一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[23-25]。大量研究證實，MAPKs信號轉(zhuǎn)導通路參與細胞分裂、分化、增殖和凋亡等多種生命體代謝活動。MAPKs信號轉(zhuǎn)導通路中三個經(jīng)典通路分別是細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、p38 MAPKs和應激活化蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路[26-27]。磷酸化的ERK由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，進而介導Elk-1、ATF、NF-κB、Ap-1、c-fos和c-Jun的轉(zhuǎn)錄活化，參與細胞增殖與分化、維持形態(tài)特征等多種生命體代謝活動[28-29]。此外，p38 MAPKs的激活與控制腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）基因表達密切相關[30]。JNK蛋白被環(huán)境壓力或某些免疫相關細胞因子激活，在免疫系統(tǒng)信號傳導中起至關重要的作用[31-32]。當巨噬細胞受到外部刺激處于激活狀態(tài)時，MAPKs相關蛋白就會出現(xiàn)磷酸化反應，進而調(diào)節(jié)NO和細胞因子的分泌[33-34]。因此，探究DHA對RAW264.7細胞中MAPKs通路中的蛋白變化情況，對闡述DHA對巨噬細胞的激活作用具有十分重要的意義。

圖9 DHA處理后RAW264.7細胞中MAPKs相關蛋白的變化情況Fig. 9 Effect of DHA on the expression of MAPKs signaling proteins in RAW264.7 cells

RAW264.7細胞MAPKs信號轉(zhuǎn)導通路結(jié)果如圖9所示，正常細胞組中，ERK1/2蛋白磷酸化程度較低，而p38和JNK蛋白磷酸化程度很低。使用600～800 ng/mL的DHA單獨誘導巨噬細胞，可以發(fā)現(xiàn)，ERK1/2、p38和JNK的磷酸化程度明顯升高，并且在800 ng/mL時磷酸化程度最高，到1 000 ng/mL時出現(xiàn)了下降。結(jié)果表明：DHA能夠引起ERK1/2、p38和JNK出現(xiàn)一定程度的磷酸化，說明DHA誘導巨噬細胞激活部分依賴了MAPKs信號轉(zhuǎn)導通路。

3 討 論

DHA具有多種生理功能，對人體的健康有著至關重要的作用，已有相關研究表明DHA在增加膜離子滲透率、增加細胞膜流動性、降低膜膽固醇含量、抗炎等多方面均有一定功效[35]。國內(nèi)外對于DHA的研究主要集中在DHA的抗癌活性上，而有關DHA免疫活性的研究相對較少。本實驗以小鼠巨噬細胞RAW264.7為研究對象，研究DHA的體外免疫活性。

巨噬細胞是一種最具有典型性的效應細胞，能夠參與機體的非特異性免疫以及特異性免疫。當巨噬細胞遭受到外來的抗原刺激之后，能夠發(fā)揮其免疫效應，其本身的吞噬能力會自發(fā)提高，檢測其吞噬能力對了解巨噬細胞的吞噬功能具有重要意義。MAPKs蛋白通路是參與細胞生長、增殖和分化等多種生理活動的重要信號通路。研究證實[36]，DHA濃度為20 μmol/L時，能夠抑制TNF-α介導的細胞信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2的滅活作用，同時顯著降低TNF-α誘導的p38和ERK1/2的mRNA表達。

在本研究中，DHA作為一種人體必需的多不飽和脂肪酸，在較低質(zhì)量濃度時（0～1 000 ng/mL），能夠促進RAW264.7的細胞增殖和吞噬活性，并具有明顯的濃度依賴關系。同時，DHA能夠增強細胞中相關酶活力，可以一定程度上上調(diào)RAW264.7細胞中MAPKs家族中ERK1/2、p38和JNK的蛋白表達情況，使細胞處于激活狀態(tài)，以上結(jié)果說明DHA可以激活RAW264.7細胞，增強機體的免疫防御能力。本研究結(jié)果證實了DHA具有一定的體外免疫調(diào)節(jié)活性。

[1] 曹萬新, 孟橘, 田玉霞. DHA的生理功能及應用研究進展[J]. 中國油脂, 2011, 36(3): 1-4.

[2] NORDOY A, MARCHIOLO R, ARNESEN H, et al. n-3 Polyunsaturated fatty acids and cardiovascular diseases: to whom, how much, preparations[J]. Lipids, 2001, 36(Suppl 1): 127-129. DOI:10.1007/s11745-001-0695-7.

[3] 許友卿, 張海柱, 丁兆坤. 二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸研究進展[J].生物學通報, 2007, 42(11): 13-15. DOI:10.3969/j.issn.0006-3193.2007.11.007.

[4] UMEMURA K, TOSHIMA Y, ASAI F, et al. Effect of dietary docosahexaenoic acid in the rat middle cerebral artery thrombosis model[J]. Thrombosis Research, 1995, 78(5): 379-387.DOI:10.1016/0049-3848(95)00071-X.

[5] VAN DE LAGEMAAT M, ROTTEVEEL J, MUSKIET F A J, et al.Post Term dietary-induced changes in DHA and AA status relate to gains in weight, length and head circumference in preterm infants[J].Prostaglandins, Leukotrienes & Essential Fatty Acids, 2011, 85(6): 311-316. DOI:10.1016/j.plefa.2011.09.005.

[6] HUFFMAN S L, HARIKA R K, EILANDER A, et al. Essential fats:how do the yaffect growth and development of infants and young children in developing countries? a literature review[J]. Maternal and Child Nutrition, 2011, 7(3): 44-65. DOI:10.1111/j.1740-8709.2011.00356.x.

[7] ENDRES S, GHORBANI R, KELLY V E, et al. The effect of dietary Supplementation with ω-3 polyunsaturated acids on the synthesis of interleukin-1and tumor necrosis factor by mononuclear cells[J]. New England Journal of Medicine, 1989, 320(5): 265-271. DOI:10.1056/NEJM198902023200501.

[8] COLAS S, MAHEO K, DENIS F, et al. Sensitization by dietary docosahexaenoic acid of rat mammary carcinoma to anthracycline: a role for tumor vascularization[J]. Clinical Cancer Research, 2006, 12(19):5879-5886. DOI:10.1158/1078-0432.CCR-06-0386.

[9] TIMMER-BOSSCHA H, HOSPERS G A P, MEIJER C, et al. Inぼuence of docosahexaenoic acid on cisplatin resistance in a human small cell lung carcinoma cell line[J]. Journal of the National Cancer Institute, 1989,81(14): 1069-1075. DOI:10.1093/jnci/81.14.1069.

[10] GLEISSMAN H, YANG R, MARTINOD K, et al. Docosahexaenoic acid metabolome in neural tumors: identification of cytotoxic intermediates[J]. The FASEB Journal, 2010, 24(3): 906-915.DOI:10.1096/fj.09-137919.

[11] 張徐寧, 戴翠萍. 二十二碳六烯酸抗癌作用的研究進展[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2010, 6(6): 165-168.

[12] LLORENTE A M, JENSEN C L, VOIGT R G, et al. Effect of maternal docosahexaenoic acid supplementation on postpartum depression and information processing[J]. American Journal of Obstetrics and Gynecology, 2003, 188(5): 1348-1353. DOI:10.1067/mob.2003.275.

[13] CALVIELLO G, DI NICUOLO F, SERINI S, et al. Docosahexaenoic acid enhances the susceptibility of human colorectal cancer cells to 5-ぼuorouracil[J]. Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 2005, 55(1):12-20. DOI:10.1007/s00280-004-0846-6.

[14] 尤麗菊. DHA的藥理作用[J]. 河南職工醫(yī)學院學報, 2008, 20(6): 619-621. DOI:10.3969/j.issn.1008-9276.2008.06.048.

[15] 賀敏, 胡世偉, 吳勝強, 等. 高含量EPA/DHA甘油三酯型魚油對小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用[J]. 中國海洋藥物, 2013, 32(4): 43-48.

[16] 彭穎, 李宗軍. 菌物多糖對巨噬細胞和樹突狀細胞的免疫刺激作用及信號通路[J]. 食品科學, 2012, 33(15): 318-323.

[17] FISHMAN M, GUNTHER G. Induction of tumor cell resistance to macrophagemediated lysis by preexposure to non-activated macrophages[J]. Cellular Immunology,1986, 99(1): 241-256. DOI:10.1016/0008-8749(86)90232-7.

[18] BROWN F M. Urine cytology. It is still the gold standard for screening?[J]. Urologic Clinics of North America, 2000, 27(1): 25-37.DOI:10.1016/S0094-0143(05)70231-7.

[19] 丁彬, 陳姣, 史青, 等. 糖原染色在急性淋巴細胞白血病診斷中的臨床意義研究[J]. 華西醫(yī)學, 2013, 28(6): 902-904. DOI:10.7507/1002-0179.20130281.

[20] BIAN T H, WANG X F, LI X Y. Effects of morphine and naloxone on proliferation of lymphocyte in vitro[J]. Acta Pharmacologica Sinica, 1995, 16(4): 315-318.

[21] HOSTETTER S J. Neutrophil function in small animals[J]. Veterinary Clinics of North America Small Animal Practice, 2012, 42(1): 157-171.DOI:10.1016/j.cvsm.2011.09.010.

[22] 胡平, 吳耿偉, 夏青, 等. SOD模擬及其抗氧化和抗炎癥功能的研究進展[J]. 化學進展, 2009, 21(5): 873-879.

[23] KITAMURA K, FUJIYOSHI K, YAMANE J, et al. Human hepatocyte growth factor promotes functional recovery in primates after spinal cord injury[J]. PLoS ONE, 2011, 6(11): e27706. DOI:10.1371/journal.pone.0027706.

[24] KOBAYASHI Y, OKADA Y, ITAKURA G, et al. Pre-evaluated safe human iPSC-derived neural stem cells promote functional recovery after spinal cord injury in common marmoset without tumorigenicity[J]. PLoS ONE, 2012, 7(12): e52787. DOI:10.1371/journal.pone.0052787.

[25] SUGA N, KATSUNO M, KOIKE H, et al. Schwann cell involvement in the peripheral neuropathy of spinocerebellar ataxia type 3[J].Neuropathology and Applied Neurobiology, 2014, 40(5): 628-639.DOI:10.1111/nan.12055.

[26] DAVIS R J. MAPKs: new JNK expands the group[J]. Trends in Biochemical Sciences, 1994, 19(11): 470-473. DOI:10.1016/0968-0004(94)90132-5.

[27] NISHIDA E, GOTOH Y. The MAP kinase cascade is essential for diverse signal transduction pathways[J]. Trends in Biochemical Sciences,1993, 18(4): 128-131. DOI:10.1016/0968-0004(93)90019-J.

[28] GEBOREK P, NILSSON E, BOLZONI F, et al. A survey of spinal collateral actions of feline ventral spinocerebellar tract neurons[J].European Journal of Neuroscience, 2013, 37(3): 380-392. DOI:10.1111/ejn.12060.

[29] WAN S C, FENG Z Z, CHEN Z X, et al. Neuroserpin upregulates in the early period of sustained spinal cord compression[J]. Clinical Laboratory, 2012, 58(9/10): 891-896. DOI:10.7754/Clin.Lab.2011.110527.

[30] BHAT N R, ZHANG P, LEE J C, et al. Extracellular signal-regulated kinase and p38 subgroups of mitogen-activated protein kinases regulate inducible nitric oxide synthase and tumor necrosis factor-alpha gene expression in endotoxin-stimulated primary glial cultures[J]. Journal of Neuroscience, 1998, 18(5): 1633-1641.

[31] DONG C, DAVIS R J, FLAVELL R A. MAP kinases in the immune response[J]. Annual Review of Immunology, 2002, 20(1): 55-72.DOI:10.1146/annurev.immunol.20.091301.131133.

[32] KARIN M, GALLAGHER E. From JNK to pay dirt: jun kinases, their biochemistry, physiology and clinical importance[J]. International Union of Biochemistry and Molecular Biology Life, 2005, 57(4/5): 283-295.DOI:10.1080/15216540500097111.

[33] AJIZIAN S J, ENGLISH B K, MEALS E A. Speciベc inhibitors of p38 and extracellular signal-regulated kinase mitogen-activated protein kinase pathways block inducible nitric oxide synthase and tumor necrosis factor accumulation in murine macrophages stimulated with lipopolysaccharide and interferon-gamma[J]. The Journal of Infectious Diseases, 1999,179(4): 939-944. DOI:10.1086/314659.

[34] CARTER A B, KNUDTSON K L, MONICK M M, et al. The p38 mitogen-activated protein kinase is required for NF-kappaB-dependent gene expression. the role of TATA-binding protein (TBP)[J]. The Journal of Biological Chemistry, 1999, 274(43): 30858-30863. DOI:10.1074/jbc.274.43.30858.

[35] GORIAO R, AZEVEDO-MARTINS A K, RODRIGUES H G,et al. Comparative effects of DHA and EPA on cell function[J].Pharmacology & Therapeutics, 2009, 122: 56-64. DOI:10.1016/j.pharmthera.2009.01.004.

[36] XUE H, WAN M F, SONG D S, et al. Eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid modulate mitogen-activated protein kinase activity in endothelium[J]. Vascular Pharmacology, 2006, 44(6): 434-439.DOI:10.1016/j.vph.2006.02.005.