異硫氰酸烯丙酯處理對鮮切紫甘藍生理代謝的影響

姜愛麗，胡文忠*，張維娜，陳 晨，劉程惠，周?；?/p>

甘藍是十字花科蕓薹屬植物[1]，富含VC、VK和多酚化合物等大量的營養(yǎng)成分及對健康有益的次生代謝產物[2]，與胡蘿卜、花椰菜并稱為“防癌三劍客”[3-4]。紫甘藍是甘藍種中的一個變種，由于富含花青素而呈紫色。近年來，鮮切蔬菜被人們稱為新世紀革命的新生食品，國外一般稱作最少加工蔬菜，又稱為半加工蔬菜、調理蔬菜、輕度加工蔬菜或切分蔬菜[5]。對于鮮切紫甘藍，國內外的食用方法主要是將其制成方便、安全的沙拉[6]，并由于其獨特的紫色，可用于什錦沙拉中增加感官品質。但鮮切產品在具有方便性和可食性的同時卻破壞了組織的完整性，擾亂了正常的生理代謝過程[7]，例如，鮮切處理會產生大量活性氧分子，對植物造成氧化傷害和代謝紊亂，加速植物的衰老進程等。

異硫氰酸烯丙酯（allyl isothiocyanate，AITC）天然存在于十字花科植物中[8-9]，其提取物是一種無色至淡黃色油狀液體，高濃度下具有強烈的揮發(fā)性，有刺激性芥子氣味，常用于制備食品添加劑、醫(yī)藥、殺蟲劑、殺菌劑等[8,10]，GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》[11]將AITC列為香料范疇。作為一種廣受關注的食品防腐劑，美國食品藥品監(jiān)督管理局將AITC的安全性等級列為一般公認安全級[10]，其對食品中常見腐敗菌、致病菌都具有很強的殺滅作用[10]，可以抵抗大腸桿菌（Escherichia coli）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、綠膿假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）以及其他病原菌[12-14]。根據流行病學資料顯示，十字花科蔬菜中的AITC及異硫氰酸鹽對嚙齒類動物肝癌、乳腺癌、肺癌、食道癌以及前胃癌有明顯的阻斷作用[15-16]，不但可以激活許多抗氧化酶或者非酶蛋白，防止發(fā)生氧化性緊張性刺激[17]，還會直接烷基化或清除掉硫醇，起到提高抗氧化能力等作用[18]。近年來關于AITC用于果蔬保鮮中的研究報道較多[19-21]，但AITC處理用于鮮切果蔬中的報道甚少。本實驗系統(tǒng)研究了AITC熏蒸處理對鮮切紫甘藍的呼吸代謝、生理品質及自身防御系統(tǒng)相關指標的影響，旨在探索最適的AITC處理方法及內在機理，為鮮切果蔬品質的提升提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、鄰苯二酚、濃鹽酸、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）、愈創(chuàng)木酚、體積分數30%H2O2、硼砂（Na2B4O7·10H2O）、硼酸（H2BO3）、L-苯丙氨酸、甲醇 天津科密歐化學試劑有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、總抗氧化能力試劑盒、羥自由基清除能力試劑盒 蘇州科銘生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

CR400/CR410型色差計 日本Konica Minolta公司；UV-9200紫外-可見分光光度計 北京瑞利分析儀器有限公司；AL240電子精密天平 瑞士Mettler-Toledo公司；DK-S26恒溫水浴鍋、DHG-9053A電熱恒溫鼓風干燥箱上海精宏實驗設備有限公司；TGL-20M高速臺式冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；T-25勻漿機德國IKA公司；LC-20AB型高效液相色譜儀 日本島津公司；酶標儀 美國Thermo Scientiベc公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

紫甘藍購買于大連開發(fā)區(qū)樂購超市，挑選大小合適、顏色正常、新鮮度高的紫甘藍，取其外層第3～7片葉片為實驗材料，將實驗材料與切割用的菜刀菜板均放在體積分數2%的次氯酸鈉溶液中浸泡10 min，取出后雙蒸水沖洗2～3 次并瀝干，然后用已消毒的菜刀菜板去除紫甘藍主脈和葉片基部1/4部分后，將葉片從中間切開，再切成0.5 cm×5 cm細絲。每處理組隨機取1 kg鮮切紫甘藍置于體積為6 L的玻璃干燥器中，用微量取樣器將揮發(fā)性化合物AITC注射在一張濾紙上，并將濾紙貼附在玻璃干燥器的內部。在20 ℃下，分別用添加量為0、5、10 μL/L的AITC密閉熏蒸16 h，每組處理重復3 次。熏蒸完畢，打開玻璃干燥器蓋子通風1 h。將鮮切紫甘藍用托盤保鮮盒進行分裝，并用線型低密度聚乙烯保鮮膜包裝（200 g/盒），后于4 ℃貯藏，分別于第0、2、4、6、8天時測定相關指標。8 d后，對照組和10 μL/L AITC處理組的鮮切紫甘藍感官上褐變和失水較嚴重（切口部位尤為嚴重），10 μL/L AITC處理組的鮮切紫甘藍局部還出現了軟化腐爛現象，因此不適宜做商品，結束實驗。

1.3.2 色澤及生理代謝指標的測定

色澤的測定采用色差計測定樣品表面的L值和a值，每處理組重復10 次。選取紫甘藍葉片主脈右側中部組織專用于色澤的測定，測定色澤時將相鄰的細絲拼接在一起進行測定，將用于色澤測定的樣品及部位做好標記，貯藏過程中始終作為色澤測定的對象。

質量損失率采用公式（1）進行計算。

式中：m0表示樣品初始質量/g；mn表示第n天的質量/g。

呼吸強度的測定參照姜愛麗等[22]的方法。

1.3.3 相關酶活力的測定

抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力和苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）活力的測定參照姜愛麗等[22]的方法。過氧化物酶（peroxidase，POD）活力和過氧化氫酶（catalase，CAT）活力的測定分別參照Wang Yousheng[23]和Pasquariello[24]等的方法。酶活力單位均以每克鮮質量每分鐘內吸光度變化量來表示，計作U，其中APX和PAL的測定波長為290 nm，POD活力的測定波長為460 nm，CAT活力的測定波長為240 nm。重復測定3 次。

1.3.4 抗氧化物質含量的測定

總酚含量的測定參照曹建康等[25]的方法并加以修改。取樣品1.0 g，加入少許體積分數為1%的鹽酸-甲醇溶液，冰浴勻漿后，再用上述鹽酸-甲醇溶液定容到20 mL，混勻后置于4 ℃條件下避光提取20 min，期間搖動數次后過濾，收集濾液待用。以上述鹽酸-甲醇溶液作參比，280 nm波長處測定濾液的吸光度，重復3 次。樣品定量采用外標法，以沒食子酸（gallic acid，GA）為標準品，準確稱取0.017 2 g的GA，用上述鹽酸-甲醇溶液溶解配制成1 mmol/L的母液，再依次稀釋為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L，并繪制標準曲線，回歸方程為y＝0.865x＋0.020 5（R2＝0.995 5）。樣品的總酚含量用每克果蔬組織相當于GA的物質的量表示，單位為mmol GA/g。

由于鮮切紫甘藍提取液呈紅色，VC含量測定若采用常規(guī)的2,6-二氯酚靛酚滴定法無法判斷滴定終點，因此參照張憲政[26]的鉬酸銨顯色法進行VC含量的測定，單位為mg/100 g。

總花色苷的提取采用Lohachoompol等[27]的方法。將樣品在5 ℃條件下用勻漿機混勻，精確稱取20 g勻漿液，用75 mL甲醇-水-醋酸溶液（25∶24∶1，V/V）提取，15 ℃、15 000×g離心15 min，收集上清液，重復提取2 次。合并2 次提取的上清液在35 ℃條件下真空蒸發(fā)，得到的殘渣用5 mL、體積分數3%甲酸的水溶液溶解，再用C18Sep-Pak cartridge柱純化。得到的花色苷在35 ℃下真空蒸干，殘渣再用1.0 mL甲醇-3%甲酸溶液（3∶17，V/V）溶解。取10 μL樣品注入帶有二極管陣列檢測器的LC-20AB型高效液相色譜儀中進行分析。色譜條件參見姜愛麗等[28]的方法。標準樣品為矢車菊-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside chloride，CGC），單位為mg CGC/g。

GSH含量參照GSH試劑盒說明書測定。

1.3.5 抗氧化能力的測定

羥自由基清除率和總抗氧化能力的測定分別參照羥自由基清除能力測試盒和總抗氧化能力測試盒說明書的方法。

1.4 數據統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 AITC處理對鮮切紫甘藍生理品質的影響

圖1 AITC處理對鮮切紫甘藍L值（A）、a值（B）、呼吸強度（C）和質量損失率（D）的影響Fig. 1 Effect of AITC treatment at different concentrations on L value (A),a value (B), respiration intensity (C) and weight loss percentage (D) of fresh-cut purple cabbage

L值表示樣品的明暗程度，L值越大說明色澤越鮮亮。如圖1A所示，貯藏期間所有樣品的L值均逐漸降低，相同貯藏時間，5 μL/L AITC處理組的L值始終高于對照組和10 μL/L AITC處理組，且與10 μL/L AITC處理組間差異達顯著性水平（P＜0.05），說明5 μL/L AITC處理更有利于保持鮮切紫甘藍的原有色澤和亮度，而10 μL/L AITC處理則加快了鮮切紫甘藍亮度的下降。

a值代表紅色（正值）和綠色（負值），5 μL/L AITC處理使鮮切紫甘藍的紅色增加，表現為a值呈先緩慢上升后迅速上升趨勢（圖1B），而對照組和10 μL/L AITC處理組的a值則呈逐漸下降趨勢，且以10 μL/L AITC處理組的a值下降速率最快。相同貯藏時間3 種處理組的a值間均差異顯著（P＜0.05）。

呼吸強度是反映果蔬采后生理代謝速率最重要的指標，由圖1C可知，鮮切紫甘藍的呼吸強度隨貯藏時間呈先上升后下降趨勢，對照組和10 μL/L AITC處理組均在第4天即達到呼吸高峰，而5 μL/L AITC處理有效地延緩了呼吸高峰的到來，在第6天時出現呼吸高峰。10 μL/L AITC處理則加快了呼吸速率，從而加速了鮮切紫甘藍的衰老進程，表現為在整個貯藏過程中呼吸強度始終顯著高于對照組和5 μL/L AITC處理組（P＜0.05）?？梢姡? μL/L AITC處理更有利于抑制呼吸速率。

紫甘藍經過鮮切加工后，會增加失水面積，導致蒸騰失水加重，所有樣品在貯藏期間的質量損失率均呈先迅速上升后緩慢上升趨勢（圖1D），相比之下5 μL/L AITC處理組的質量損失率上升較緩慢，并在第4、6、8天時與其他兩組相比差異達顯著性水平（P＜0.05）。10 μL/L AITC處理組的質量損失率高于5 μL/L AITC處理組，但與對照組差異不顯著（P＞0.05）。實驗結束時（第8天），對照組和10 μL/L AITC處理組的鮮切紫甘藍切口部位褐變程度較重，尤其是10 μL/L AITC處理組，局部還出現了軟化現象，而5 μL/L AITC處理的鮮切紫甘藍外觀品質與0 d時相比基本無變化。

2.2 AITC處理對鮮切紫甘藍相關酶活力的影響

圖2 AITC處理對鮮切紫甘藍PPO（A）、PAL（B）、POD（C）和APX（D）活力的影響Fig. 2 Effect of AITC treatment at different concentrations on PPO (A),PAL (B), POD (C) and APX (D) activity of fresh-cut purple cabbage

PPO不僅催化果蔬產生褐變反應，還與植物抗性密切相關[28]。如圖2A所示，貯藏期間，所有樣品的PPO活力均呈逐漸上升趨勢，其中5 μL/L AITC處理組的PPO活力低于對照組和10 μL/L AITC處理組，且上升趨勢最小，10 μL/LAITC處理組的PPO活力顯著高于同一貯藏期其他處理組（P＜0.05）。

PAL是許多植物次生物質生物合成途徑——苯丙烷代謝的關鍵酶，與植物的抗逆境脅迫和抗病性相關，在植物的正常生長發(fā)育和抵御病原菌侵害過程中起著重要的作用[28]。由圖2B可見，貯藏期間PAL活力均呈先上升后下降趨勢，其中對照組和10 μL/L AITC處理組在第2天時即達到活力高峰，后逐漸下降，而5 μL/L AITC處理組的PAL活力在第4天時達到高峰，在第4、6天和8天時，5 μL/L AITC處理組的PAL活力顯著高于其他組（P＜0.05）?？梢?，5 μL/L AITC處理組可維持較高的PAL活力，有利于紫甘藍抵抗傷害脅迫。

POD和APX活力均呈先上升后下降趨勢（圖2C、D），各處理組的POD活力在第6天時出現高峰，而APX活力在第2天時最高。5 μL/L AITC處理組的POD和APX活力在貯藏過程中始終顯著高于對照組和10 μL/L AITC處理組（P＜0.05）。POD和APX對植物體的保護作用均是通過分解H2O2來抵抗氧化脅迫，其中APX是通過專一性地催化VC與H2O2反應形成單脫氫H2O2，從而降低H2O2對植物體的危害。APX是抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)系統(tǒng)重要的工具酶，APX活力的上升可能是導致VC降解的原因之一。

2.3 AITC處理對鮮切紫甘藍抗氧化物質含量的影響

紫甘藍中富含多酚、花色苷、VC等抗氧化物質，因此具有較強的抗氧化能力[1]。實驗結果表明：鮮切紫甘藍的總酚和總花色苷含量變化趨勢相似，二者均呈先上升后下降趨勢（圖3A、B），其中對照組和10 μL/L AITC處理組的總酚和總花色苷含量均在第2天時達到峰值，而5 μL/L AITC處理組則在第4天時最高，且2 d后，5 μL/L AITC處理組的總酚和總花色苷含量均顯著高于對照組和10 μL/L AITC處理組（P＜0.05），說明適宜添加量的AITC處理有利于鮮切紫甘藍中酚類物質的保持。對照組和兩種AITC處理組的鮮切紫甘藍中總酚含量及總花色苷含量在前2 d內均有所增加，這種現象在藍莓的貯藏過程中也出現過[14]，Wang等[14]的研究結果表明，藍莓果實的花色苷和酚類物質在采后貯藏過程中依然會繼續(xù)合成。

圖3 不同添加量AITC處理對鮮切紫甘藍總酚（A）、總花色苷（B）、VC（C）和GSH（D）含量的影響Fig. 3 Effect of AITC treatment at different concentrations on phenol (A), total anthocyanin (B), VC (C) and GSH (D) of fresh-cut purple cabbage

作為重要的營養(yǎng)物質和抗氧化物質，VC在貯藏過程中呈下降趨勢（圖3C），但5 μL/L AITC處理能降低VC含量下降的速率，表現為第2天和第6天時VC含量顯著高于同期的對照組和10 μL/L AITC處理組（P＜0.05）。GSH作為一種重要的非酶抗氧化物質，在紫甘藍中含量很高，GSH在抗氧化、蛋白質巰基保護和氨基酸跨膜運輸等方面具有重要作用[31]。如圖3D所示，貯藏期間，GSH含量整體呈先上升后下降趨勢，10 μL/L AITC處理組在第2天時達到峰值后急速下降，其他2 組的GSH含量在第6天時達到峰值，4 d后，5 μL/L AITC處理組的GSH 含量顯著高于其他2 組（P＜0.05）。綜上，5 μL/L AITC處理更有利于保持GSH不被破壞，而10 μL/L AITC處理效果相反。

2.4 不同添加量AITC處理組對鮮切紫甘藍抗氧化能力的影響

圖4 不同添加量AITC處理對鮮切紫甘藍羥自由基清除率（A）和總抗氧化能力（B）的影響Fig. 4 Effect of AITC treatment at different concentrations on hydroxyl radical-scavenging capacity (A) and total antioxidant capacity (B) of fresh-cut purple cabbage

如圖4A所示，對照組和10 μL/L AITC處理組的羥自由基清除率整體呈緩慢下降趨勢，而5 μL/L AITC處理組則呈先上升后下降趨勢，在第2天時達到峰值，并且在整個貯藏期間羥自由基清除率始終顯著高于其他兩組（P＜0.05）。由圖4B可見，鮮切紫甘藍的總抗氧化能力呈先上升后下降趨勢，10 μL/L AITC處理組在第2天時達到峰值，而對照組和5 μL/L AITC 處理組均在第4天時達到峰值，2 d后，5 μL/L AITC 處理組的總抗氧化能力顯著高于其他處理組（P＜0.05），而10 μL/L AITC處理組的總抗氧化能力降低最快。綜上，5 μL/L AITC處理能有效地保持鮮切紫甘藍的羥自由基清除能力和總抗氧化能力。

2.5 不同添加量AITC處理組鮮切紫甘藍生理代謝影響的PCA和Pearson相關性分析結果

PCA是一種針對于多變量的統(tǒng)計分析方法，可以從多元事物中解析出主要影響因素，揭示事物的本質，使復雜問題簡單化[29-30]。如圖5A所示，將12 個原始指標綜合為兩個主成分PC1和PC2，這兩個主成分分別占數據集總方差的46.857%和25.267%（所有數據均進行標準化）[30]，PC1與總酚、總花色苷、VC含量呈高度相關，PC2與POD、PPO、APX活力及GSH含量呈高度正相關。由圖5B可知，與對照組相比，5 μL/L AITC處理組的鮮切紫甘藍的綜合評分均處于較高水平，其中5 μL/L AITC處理組在第6天處于最高水平，10 μL/L AITC處理組在第2天時處于最高水平，但隨著貯藏時間的延長，綜合評分呈下降趨勢，且在第4天時顯著低于對照組（P＜0.05），說明10 μL/L AITC處理加速了鮮切紫甘藍的生理代謝，促進了鮮切紫甘藍的衰老，而5 μL/L AITC處理最有利于保持鮮切紫甘藍的品質和營養(yǎng)價值。

圖5 不同添加量AITC處理對鮮切紫甘藍各生理指標的主成分載荷（A）和綜合得分（B）的影響Fig. 5 Effect of AITC treatment at different concentrations on principal component loading (A) and comprehensive scores (B) for physiological indexes of fresh-cut purple cabbage

表1 各生理指標的相關性Table 1 Correlations of physiological indexes

由表1相關性分析結果可知，PPO活力與L值間存在著極顯著負相關關系（P＜0.01），R2＝0.92，而PPO活力與代表紅色程度的a值間卻不存在相關性關系（R2＝0.31），說明鮮切紫甘藍由PPO催化的褐變反應主要是引起亮度的下降。

3 結 論

5 μL/L AITC處理有利于保持紫甘藍原有的亮度，降低了褐變程度；5 μL/L AITC處理降低了質量損失率，并抑制了呼吸代謝速率，而10 μL/L AITC處理則提高了貯藏前期鮮切紫甘藍的PPO活力、GSH含量和總抗氧化能力，并提高了呼吸強度上升的速率，導致樣品色澤逐漸暗淡且在第6天時開始有明顯腐爛現象的發(fā)生，質量損失率也顯著高于對照組，盡管2 d時10 μL/L AITC處理組的綜合得分最高，但接下來急劇下降，可見AITC添加量過高會加快呼吸代謝速率，加速衰老進程。

5 μL/L AITC處理可能是通過啟動鮮切紫甘藍的自身防御系統(tǒng)來起到保鮮的作用。5 μL/L AITC處理均不同程度地提高了鮮切紫甘藍抗性相關酶（POD、PAL、APX）活力，表現為抗氧化物質含量的增加和抗氧化能力的提高。當然，要進一步驗證這一結論，還需對自由基變化情況等一系列活性氧代謝指標做進一步研究。

以上結論表明：5 μL/L AITC處理能夠對鮮切紫甘藍起到保鮮作用，較好地保持其營養(yǎng)成分和抗氧化能力，并可更有效地降低呼吸強度。雖然AITC是公認的抗菌劑，但因其高波動性和強烈的氣味，其在食品中的應用也是有限度的[18]，AITC添加量過高反而會破壞鮮切紫甘藍正常的生理代謝過程，使得代謝紊亂，加速衰老進程[32]。本研究所選擇的AITC處理添加量和處理時間是經過大量預實驗選定的結果，盡管10 μL/L AITC處理加速了鮮切紫甘藍貯藏后期的衰老進程，但該添加量處理后的產品無論是鮮食還是烹飪均沒有風味上的劣變。

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