PDK1對(duì)肺癌A549細(xì)胞生物學(xué)行為的影響*

李蘇霞， 何釬鋮， 陳素秀

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科， 浙江 溫州 325000)

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率及死亡率；其中非小細(xì)胞肺癌是主要的類型，早期診斷并給予有效的治療對(duì)提高患者生存率具有重要的臨床意義[1]。隨著生物信息學(xué)及基因測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，研究者們發(fā)現(xiàn)基因的異常表達(dá)是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素之一；針對(duì)這些異?；虻陌邢蛑委熆赡転榉伟┑膫€(gè)體化診療提供新的思路和方向[1-3]。作為臨床應(yīng)用基礎(chǔ)研究，探討肺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)基因，對(duì)于尋找有效的診療靶點(diǎn)具有重要的意義。

3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1)是一個(gè)大小為67 kD 的絲/蘇氨酸蛋白激酶，屬于AGC家族上游的主要調(diào)控因子之一，對(duì)細(xì)胞的生長、分化及凋亡等病理生理過程具有重要的調(diào)節(jié)作用[4-5]。研究顯示在包括乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和胰腺癌等惡性腫瘤中，PDK1均呈現(xiàn)高表達(dá)，推測(cè)其可能作為一種原癌基因參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6-8]。Lian等[9]的研究顯示， PDK1可通過上調(diào)JunB促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移；Hsu等[10]的研究顯示，表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)誘導(dǎo)的PDK1可通過上調(diào)纖維連接蛋白促進(jìn)頭頸鱗癌的轉(zhuǎn)移。但尚未有研究直接以PDK1作為靶點(diǎn)，研究其對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的具體作用及相關(guān)機(jī)制。本研究利用RNA干擾技術(shù)敲減人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549中PDK1的表達(dá)，探討PDK1基因?qū)549細(xì)胞的活力、周期及凋亡等生物學(xué)特性的影響和潛在的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料與試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基及胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco；肺正常上皮細(xì)胞BEAS-2B和肺癌細(xì)胞(H460、SPCA1和A549)均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；抗PDK1、叉頭框蛋白O1(forkhead box protein O1, FoxO1)、p-FoxO1(S256)、p-FoxO1(T24)及p-Akt/Akt單克隆抗體購自CST；抗cyclin D1、CDK4、p-Rb/Rb、P27、Bcl-2、cleaved caspase-3/caspase-3及β-actin抗體購自Abcam；CCK-8細(xì)胞活力分析試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；Akt激動(dòng)劑胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1， IGF-1)購自大連寶生物公司；細(xì)胞周期及凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京凱基公司；Nc-細(xì)胞核/漿蛋白抽提試劑盒購自北京康為世紀(jì)公司；PDK1小干擾RNA(PDK1 small interfering RNA，si-PDK1)及其陰性對(duì)照(negative，Neg)序列由Genescript公司設(shè)計(jì)并合成；相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑和SYBR Green I Real-Time PCR Kit購自Invitrogen；其余試劑均為國產(chǎn)市售分析純。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組 實(shí)驗(yàn)用肺癌細(xì)胞株及肺正常上皮細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中(含10% FBS和100 mg/L青霉素及鏈霉素),置于37 ℃、5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱。每2 d換液，3～5 d傳代。siRNA轉(zhuǎn)染：將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種至6孔板，待細(xì)胞生長到80%融合，同步化12 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將siRNA和 Lipofectamine 2000分別溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育5 min后輕柔混勻，靜置反應(yīng)20 min而后將混合物加入相應(yīng)組別的細(xì)胞中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，更換為完全細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。組別設(shè)置為空白對(duì)照(control)組、Neg組和si-PDK1組。提取細(xì)胞總RNA及蛋白測(cè)定轉(zhuǎn)染效率并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

2.2CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中(每孔2×103)，各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 h，向每孔加入10 μL 的CCK-8試劑，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm波長處的吸光度(A)值，并計(jì)算細(xì)胞活力。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔取平均值，同時(shí)另設(shè)單孔只加入培養(yǎng)基作空白對(duì)照。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 依據(jù)說明書要求進(jìn)行操作，用不含EDTA的胰酶消化各組細(xì)胞，加PBS漂洗3次后離心收集細(xì)胞，而后用70%乙醇避光固定過夜(4 ℃)。次日，1 000×g離心洗去乙醇，并避光加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)染液，37 ℃孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Ex=488 nm處的熒光強(qiáng)度，并分析在細(xì)胞周期各期中細(xì)胞所占的百分比。

2.4Annexin V/PI 雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 依據(jù)說明書要求進(jìn)行操作，用不含EDTA的胰酶消化各組細(xì)胞，加PBS漂洗3次后離心收集細(xì)胞，而后加Binding Buffer重懸細(xì)胞。先后加入Annexin V-FITC(避光孵育10 min)和PI染液(避光孵育5 min)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Ex=488 nm和Em=530 nm處的熒光強(qiáng)度，并分析細(xì)胞早期及中晚期凋亡率。

2.5Real-time PCR 依據(jù)Trizol一步法說明書的要求提取各組細(xì)胞中的總RNA。所提RNA經(jīng)純化及定量后，取2 μg逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后采用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光PCR的方法檢測(cè)PDK1的mRNA表達(dá)。PCR反應(yīng)條件為 95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)；以β-actin為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。PDK1的上游引物序列為5’-AAGATGAGTGACCGAGGAGGT-3’，下游引物序列為5’-CCATAACCAAAACCAGCCAGAG-3’；β-actin的上游引物序列為5’-ACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATC-3’，下游引物序列為5’-ATCCTTCTGACCCATGCCCACCA-3’。

2.6Western blot測(cè)定蛋白表達(dá)水平 用含cocktail的RIPA裂解液提取各組細(xì)胞蛋白(核蛋白和胞漿蛋白的提取依據(jù)試劑盒說明進(jìn)行)，經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量分析后調(diào)整各組蛋白上樣總量至80 μg，加入4倍體積的Loading Buffer，而后沸水煮5 min。上樣并進(jìn)行SDS-PAGE。待藍(lán)色的Loading Buffer泳出分離膠后將蛋白經(jīng)200 mA恒流電轉(zhuǎn)至PVDF膜，加5%脫脂牛奶室溫封閉90 min。依據(jù)說明書要求加入相應(yīng)比例的 I 抗，4 ℃孵育過夜，復(fù)溫后去掉 I 抗孵育液并用TBST洗滌3次，每次5 min；而后加入對(duì)應(yīng)的 II 抗室溫孵育120 min，TBST洗滌3次，每次10 min，暗室中經(jīng)ECL發(fā)光液顯影后定影并沖洗膠片。所得結(jié)果錄入電腦后，用ImageJ行蛋白半定量灰度分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)均錄入SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組計(jì)量資料的組間差異采用t檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料行單因素方差分析，同時(shí)采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)組間的兩兩比較，計(jì)數(shù)資料的比較采用2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1PDK1的表達(dá)及干擾效率檢測(cè)

首先采用real-time PCR和Western blot檢測(cè)肺正常上皮細(xì)胞BEAS-2B及幾種肺癌細(xì)胞(H460、SPCA1和A549)中PDK1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，相較于肺正常細(xì)胞BEAS-2B，肺癌細(xì)胞中PDK1表達(dá)均明顯增加，且A549中PDK1的表達(dá)最高(P<0.05)，故而后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用A549細(xì)胞進(jìn)行，見圖1A、B。

將si-PDK1轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，分別采用real-time PCR和Western blot檢測(cè)干擾效率。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了si-PDK1之后，A549細(xì)胞PDK1的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，效果較好，可繼續(xù)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析，見圖1C、D。

Figure 1. The expression of PDK1 in lung cancer cells. A: the mRNA expression of PDK1 in the normal lung epithelial cell line BEAS-2B and lung cancer cell lines; B: the protein expression of PDK1 in normal lung epithelial cell line BEAS-2B and lung cancer cell lines; C: the mRNA expression of PDK1 in A549 cells after transfection with si-PDK1; D: the protein expression of PDK1 in A549 cells after transfection with si-PDK1. Mean±SD.n=6.△P<0.05vsBEAS-2B group;*P<0.05vscontrol group.

圖1正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B和肺癌細(xì)胞的PDK1表達(dá)水平及轉(zhuǎn)染si-PDK1的影響

2干擾PDK1抑制細(xì)胞活力并影響細(xì)胞周期分布

用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低PDK1表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，si-PDK1組的細(xì)胞活力明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，見圖2A。

進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的周期分布，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，si-PDK1組處于G0/G1期的細(xì)胞所占百分比增加(P<0.05)，S期細(xì)胞所占百分比減少(P<0.05)，說明干擾PDK1表達(dá)可抑制A549細(xì)胞的細(xì)胞周期由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換，見圖2B。

3干擾PDK1促進(jìn)細(xì)胞凋亡

用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染法檢測(cè)A549細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，si-PDK1組的早期凋亡率增加(P<0.05)，表明干擾PDK1表達(dá)可明顯促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549的凋亡，見圖3。

Figure 2. The effect ofPDK1 knockdown on on the viability and cell cycle distribution of A549 cells. A: the cell viability measured by CCK-8 assay; B: the cell cycle distribution measured by flow cytometry. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖2干擾PDK1對(duì)A549細(xì)胞活力和細(xì)胞周期分布的影響

Figure 3. The effect ofPDK1 knockdown on the apoptosis of A549 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖3干擾PDK1對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

4細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)調(diào)控因子的蛋白表達(dá)水平

采用Western blot檢測(cè)干擾PDK1表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞的周期及凋亡相關(guān)調(diào)控因子表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，干擾PDK1后，與對(duì)照組相比，A549細(xì)胞中cyclin D1、CDK4、p-Rb及Bcl-2的蛋白水平顯著下降(P<0.05), P27及cleaved caspase-3的蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見圖4。

Figure 4. The effect ofPDK1 knockdown on the protein levels of cell cycle- and apoptosis-related molecules in the A549 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖4干擾PDK1對(duì)A549細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)因子蛋白水平的影響

5干擾PDK1對(duì)Akt/FoxO1信號(hào)通路活性的影響

進(jìn)一步采用Western blot檢測(cè)干擾PDK1表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞Akt/FoxO1信號(hào)通路活性的影響，結(jié)果示，干擾PDK1后，A549細(xì)胞胞漿中p-FoxO1(S256)和p-FoxO1(T24)的含量及p-Akt/Akt的水平顯著降低，而細(xì)胞核內(nèi)FoxO1的含量顯著增加(P<0.05)；而預(yù)先給予Akt激動(dòng)劑IGF-1可部分逆轉(zhuǎn)PDK1的表達(dá)及對(duì)Akt/FoxO1信號(hào)通路的抑制，并增加A549細(xì)胞的活力，見圖5。

討 論

隨著人們對(duì)肺癌的認(rèn)識(shí)逐漸加深，以某一基因?yàn)榘悬c(diǎn)開展的診療成為肺癌個(gè)性化治療的新方向，研究提示，PDK1可能發(fā)揮抑癌基因的作用，但其是否可作為肺癌診療的直接靶點(diǎn)還須大量的研究驗(yàn)證。眾所周知，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和凋亡抵抗密不可分；而PDK1作為細(xì)胞內(nèi)重要的激酶對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡具有顯著的調(diào)控作用[9, 11]。本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果顯示，PDK1在肺癌細(xì)胞中高表達(dá)，且A549細(xì)胞中PDK1的表達(dá)水平最高，然后我們通過外源性干擾人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中的PDK1表達(dá)，探討PDK1對(duì)肺癌細(xì)胞的活力及凋亡等生物學(xué)特性的影響。CCK-8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期檢測(cè)顯示，干擾PDK1后，A549細(xì)胞的活力顯著降低，并呈現(xiàn)G1/S細(xì)胞周期阻滯；同時(shí)細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示，A549細(xì)胞的早期凋亡率明顯增加。這一結(jié)果提示在肺癌中，PDK1可能是通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的活力及凋亡促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。

關(guān)于PDK1調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡的潛在機(jī)制，先前報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到干擾PDK1后，A549細(xì)胞周期出現(xiàn)G1/S阻滯，而細(xì)胞周期的G1/S轉(zhuǎn)換受到一系列周期相關(guān)因子的調(diào)控。其中細(xì)胞周期素(cyclins)可與細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)結(jié)合形成復(fù)合物，而CDK抑制劑(CDK inhibitor, CDKI)如P21和P27等則可抑制CDK的激活； Rb具有閘門的作用，其磷酸化可促使細(xì)胞越過G1/S調(diào)控點(diǎn)進(jìn)入S期[12-14]。本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)干擾PDK1后，A549細(xì)胞中cyclin D1、CDK4和p-Rb的蛋白水平顯著降低，而P27的蛋白表達(dá)水平顯著升高。細(xì)胞凋亡是一個(gè)涉及多個(gè)因素及多條通路的復(fù)雜病理生理過程，其中Bcl-2是最具代表性的凋亡抑制因子，caspase-3則是重要凋亡效應(yīng)蛋白，也是多條凋亡信號(hào)的共同通路[15-16]。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，干擾PDK1可下調(diào)A549細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞中cleaved caspase-3的表達(dá)顯著升高?？紤]到細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)通常與復(fù)雜的信號(hào)通路相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析了該過程中涉及的信號(hào)通路。

從結(jié)構(gòu)上分析，PDK1包括N端的絲/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域和C端的血小板-白細(xì)胞C激酶底物同源性(pleckstrin homology，PH)結(jié)構(gòu)域2個(gè)重要的功能結(jié)構(gòu)域，其中PH域可與磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)的刺激產(chǎn)物PIP3結(jié)合，并調(diào)控AGC家族下游激酶的磷酸化，而Akt則是其中重要的中介因子[17-19]。本實(shí)驗(yàn)中干擾A549細(xì)胞中的PDK1可抑制Akt的磷酸化。眾所周知，Akt信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞生長增殖的重要通路[19]，說明PDK1對(duì)A549細(xì)胞生長和凋亡的調(diào)控作用與Akt信號(hào)通路密切相關(guān)。此外，F(xiàn)oxO1是一類抑癌的轉(zhuǎn)錄因子，核內(nèi)的FoxO1可行使轉(zhuǎn)錄因子的功能，調(diào)控細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)；但Akt可致FoxO1磷酸化，使其由胞核轉(zhuǎn)至胞漿，失去轉(zhuǎn)錄活性[20-21]。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了Akt通路下游重要的調(diào)控因子FoxO1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，干擾PDK1后，A549細(xì)胞中胞漿p-FoxO1(S256)和p-FoxO1(T24)的含量顯著降低，而細(xì)胞核內(nèi)FoxO1的含量顯著增加。為進(jìn)一步驗(yàn)證PDK1與Akt信號(hào)通路的相互作用，本實(shí)驗(yàn)通過預(yù)孵Akt激動(dòng)劑IGF-1觀察PDK1的表達(dá)及Akt/ FoxO1信號(hào)通路的活性。結(jié)果顯示，相較于PDK1干擾組，預(yù)孵IGF-1可部分上調(diào)PDK1的蛋白表達(dá)，同時(shí)增加了FoxO1的磷酸化出核；此外還可部分上調(diào)A549的細(xì)胞活力。以上結(jié)果表明干擾PDK1可抑制Akt的磷酸化進(jìn)而減少FoxO1的磷酸化出核，上調(diào)核內(nèi)活性的FoxO1，從而降低A549細(xì)胞的活性發(fā)揮抑癌作用?；虻恼{(diào)控往往是多條信號(hào)通路共同作用的結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了常見的Akt/FoxO1通路，而這其中是否涉及其它信號(hào)通路還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

Figure 5. The interaction between PDK1 and Akt/FoxO1 pathway in A549 cells. A: the activation of Akt/FoxO1 pathway in A549 cells; B: the changes of the viability of A549 cells with different treatments. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssi-PDK1 group.

圖5A549細(xì)胞中PDK1與Akt/FoxO1信號(hào)通路的相互作用

綜上所述，在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549中，干擾PDK1可通過Akt/FoxO1信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞活力并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

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