謝川東 文燕 曾昱偉 王星 高盼奇 陳紅英

摘要：為探究黃連（Coptis chinensis Franch.）抗菌活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為試驗菌進行抗菌活性測試，對黃連不同的溶劑提取物、組分、化合物進行分析。結(jié)果表明，黃連對兩種菌均有一定的抗菌活性，不同試驗樣品對兩種菌的抑菌趨勢一致，在同一試驗濃度下，對金黃色葡萄球菌的抑制活性明顯強于大腸桿菌。具體表現(xiàn)為100%醇提物>50%醇提物>水提物;不同組分中，總堿的抗菌活性最強，而總堿和多糖顯示微弱的抗菌活性;對總堿進一步分離得到4個生物堿（小檗堿、黃連堿、巴馬亭、表小檗堿），其中小檗堿和黃連堿對兩種試驗菌的活性最強，但在同一濃度下，小檗堿活性弱于總堿。黃連抗菌活性成分主要來源于生物堿部分，不同成分之間可能存在協(xié)同抗菌關(guān)系。

關(guān)鍵詞：黃連（Coptis chinensis Franch.）;小檗堿;組分;生物堿;抗菌

中圖分類號：R282? ? ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）23-0085-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.23.019? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

由于人類在抗炎癥疾病和農(nóng)漁牧業(yè)養(yǎng)殖中不合理使用抗生素，導(dǎo)致耐藥菌株不斷增加。目前，臨床上可供選擇的抗菌素越來越少。在人類與疾病的抗?fàn)幨分校胁菟幱糜谘装Y的治療有明確記載。從中草藥中發(fā)現(xiàn)新的抗菌藥成為很多醫(yī)藥學(xué)者研究的目標(biāo)。

黃連，為毛茛科植物黃連（Coptis chinensis Franch.）的干燥根莖。因其根莖呈連珠狀而色黃，所以稱之為黃連，是一種臨床常用的抗菌抗病毒中藥。黃連抗菌譜很廣，對革蘭氏陽性菌、陰性菌、各型流感病毒及真菌類均有一定的抑制作用[1]，其主要成分為異喹啉生物堿，其中小檗堿含量較高。小檗堿又名黃連素，有良好的抗菌效果。有研究報道，黃連對幽門螺桿菌的體外抗菌活性優(yōu)于小檗堿[2]。前期試驗發(fā)現(xiàn)，黃連降糖、抗氧化活性均優(yōu)于小檗堿[3，4]。為探討小檗堿以外的黃連抗菌成分，本試驗以革蘭氏陰性菌大腸桿菌（Escherichia coil）和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為指示菌，對黃連不同極性的組分進行抗菌活性跟蹤，以期為這方面研究提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

黃連購于四川省天府神龍中藥飲片有限公司。菌種金黃葡萄球菌和大腸桿菌由西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院菌種儲藏室提供。

紫外分光光度計（UV2400型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）;高速逆流色譜（TBE-300B型，上海同田生化有限公司）;微量分析天平（TP-214型，美國丹佛儀器有限公司）;超聲清洗機（KQ32002型，昆山市超聲儀器有限公司）;高壓滅菌鍋（MLS-3780型，日本三洋公司）;恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9162型，上海齊欣科學(xué)儀器公司）;超凈工作臺（SW-CJ-1F型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

小檗堿、巴馬亭、黃連堿、表小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品均購于上海純優(yōu)生物科技有限公司，純度均大于98%。鏈霉素和紅霉素藥敏紙片購于北京普納德科技有限公司，其余試劑均為分析純。

1.2? 方法

1.2.1? 不同溶劑的提取? 精密稱取適量過篩的黃連粗粉100 g 3份，分別用適量的水、50%乙醇、無水乙醇在70 ℃下超聲提取1 h，再用相應(yīng)的溶劑配成1 g/mL的藥劑。

1.2.2? 黃連不同組分的制備

1）提取流程：黃連粉碎過篩后，取黃連粗粉適量，按照以下工藝流程分別制備極性不同的黃連組分，如圖1所示。經(jīng)過不同流程，黃連粗提物被分為黃連總堿、非生物堿、多糖3個部分。

2）多糖的提取與分析

多糖的提取：精密稱取粉碎至20目的黃連粗粉100 g，置于索氏提取器中，用3倍超純水回流脫脂6 h。按照參考文獻[5]的方法提取制備黃連多糖。

定性分析：Molish試驗進行檢測。如樣品含有糖類成分，將在液面交界處很快出現(xiàn)紫紅色環(huán)。搖勻后顏色變深，冷卻后加水稀釋會出現(xiàn)暗紫色沉淀。

定量分析：參看文獻[6]苯酚-硫酸法測定總糖的含量。平行測定3次取平均值。

3）黃連中總堿和非生物堿的提?。喊凑丈鲜龉に嚵鞒蹋瑓⒄瘴墨I[7]的方法，提取制得黃連非生物堿，參照文獻[8]的方法得到黃連總堿。

1.2.3? 抗菌活性試驗

1）藥液制備：精密稱取黃連分離得到的不同組分，用少許去離子水超聲溶解，分別配成1、2、5? ?mg/mL的濃度。不同溶劑的黃連提取物均為1 g/mL的生藥濃度。

2）含藥紙片的制備：取一定數(shù)量的濾紙片（直徑6 mm），分別加入上述制備的不同濃度藥液，完全浸泡紙片2.0 h，吹干，高溫滅菌30 min，取出放在紫外通風(fēng)櫥中吹干備用。用相同的溶劑浸泡紙片同法操作，作為陰性對照。

3）菌懸液的制備：取活化好的大腸桿菌和金黃葡萄球菌的平板洗滌，通過麥?zhǔn)媳葷岷惋@微鏡計數(shù)的方法配成1.0×108 cuf/mL菌懸液備用。

4）濾紙片法：準(zhǔn)確吸取菌液0.1 mL均勻涂布于瓊脂平板培養(yǎng)基的全部表面，用滅菌鑷子將制備好的濾紙片貼于瓊脂平板表面，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h后取出，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。每個菌種重復(fù)3次，求均值。

1.3? 色譜分離

對抗菌活性最強的總堿組分，采用高速逆流色譜法（HSCCC）進行分離純化。以氯仿∶甲醇∶0.2 mol/L鹽酸（2∶1∶1）的比例配置溶劑體系，上相為固定相，下相為流動相。精密稱取適量總堿，用流動相溶解配置成20 mL溶液。參照文獻方法[3]，溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速850 r/min，流速2 mL/min，檢測波長254 nm，待兩相體系達到平衡后，將樣品溶液注入主機中，根據(jù)色譜工作站圖譜收集各色譜峰。

各色譜峰的定性與定量按照中國藥典（2015版）用TLC法和HPLC法的相同條件進行。

1.4? MIC測定

將上述色譜分離制得的色譜峰溶液減壓濃縮至干后，配成4.00 mg/mL的藥液。參照文獻方法[9]，按倍比稀釋法，用肉湯液體培養(yǎng)基將藥液分別稀釋為10個濃度：1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，? ?1∶256，1∶512，1∶102 4。試驗用試管分別加入液體培養(yǎng)基100 μL，試驗菌液20 μL，藥液120 μL，混勻后，置于37 ℃培養(yǎng)24 h。肉眼觀察每支試管的澄清度。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 不同溶劑提取物抗菌活性

當(dāng)黃連提取物濃度為1 g/mL時，不同溶劑提取物對2種試驗菌均有抑菌效果，其對金黃色葡萄球菌的抗菌活性明顯優(yōu)于大腸桿菌，具體結(jié)果見表1。不同溶劑提取物分別對2種菌的抑制趨勢一致，其活性強弱從大到小均為100%醇提物>50%醇提物>水提物。水提物對大腸桿菌沒有抗菌活性。

不同溶劑提取黃連，提取的成分明顯不同。根據(jù)性相近則相容的原則，水提物含有多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、多酚、生物堿、木質(zhì)素等成分，而無水乙醇提取物中，多糖、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)幾乎未被提出，主要是小分子有機物，含水醇提物的成分介于二者之間。從上述結(jié)果看，對2種試驗菌有抑菌活性的主要是小分子的有機物。為進一步了解黃連抗菌活性成分，用化學(xué)方法把黃連分成不同極性組分。

2.2? 黃連組分提取分離結(jié)果

將黃連按照試驗流程分成3個組分：多糖、非生物堿、總堿。多糖為大分子，生物堿為黃連的主要組分，非生物堿是除掉兩者以后的其余部分。從100 g黃連粉末中，按照工藝流程得到3.15 g黃連總堿，1.23 g非生物堿，0.51 g多糖。多糖的定性試驗顯示有明顯的紫色環(huán)。葡萄糖對照品標(biāo)準(zhǔn)方程為y=12.24x+0.067 6，r2=0.999， 其中y代表吸光度，x代表葡萄糖濃度（mg/mL）。粗多糖中多糖的含量為29.31%。

2.3? 組分抑菌活性結(jié)果與分析

3種組分總堿、非生物堿、多糖的試驗濃度均為5 mg/mL，用總堿、非生物堿、多糖制作的藥敏紙片載藥量為50 μg/片，組分抑菌活性結(jié)果見下表2。從表2可以看出，在試驗濃度下，黃連多糖和非生物堿對2種試驗菌都不敏感，而黃連總堿的抗菌活性較為明顯，對2種菌表現(xiàn)高度的敏感。非生物堿和多糖的表現(xiàn)較弱，這與前面水提物的活性不如醇提物的活性結(jié)果一致，黃連抗菌活性主要貢獻來源于總堿。普遍認為，黃連主要成分小檗堿對痢疾桿菌、炭疽桿菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肺炎雙球菌以及腦膜炎雙球菌等均有較強抑制作用[10]。從上述結(jié)果看，在同樣試驗條件下，小檗堿對2種試驗菌的活性明顯弱于黃連總堿，這說明黃連總堿中還有其他成分與小檗堿協(xié)同起抗菌作用。

2.4? 總堿分離結(jié)果

黃連總堿通過高速逆流色譜儀進行液液色譜分離，無損分離純化，按照餾出峰進行收集。色譜分離結(jié)果見圖2。共收集4個色譜峰的黃色溶液，分別濃縮重結(jié)晶后，經(jīng)TLC和HPLC分析，與標(biāo)準(zhǔn)品進行比對，4個色譜峰分別為巴馬亭、小檗堿、表小檗堿和黃連堿，純度均大于96%，結(jié)果與文獻[3]報道一致。這4個化合物均為黃連的生物堿，在中國藥典中為黃連質(zhì)控的主要指標(biāo)成分，其結(jié)構(gòu)式見圖3。

在色譜分離過程中發(fā)現(xiàn)，溶劑體系的pH對色譜的出峰時間有很大影響。當(dāng)體系pH由3變?yōu)?時，出峰時間可以減少2.0 h左右，而分離度變化不大。

2.5? 4種生物堿的抑菌結(jié)果

4種生物堿均有抑菌效果，它們的最小抑菌濃度測試結(jié)果見表3。抑制金黃色葡萄球菌的活性大小順序為為小檗堿、黃連堿>巴馬亭、表小檗堿;抑制大腸桿菌的活性大小順序為黃連堿>小檗堿>表小檗堿>巴馬亭，與文獻報道基本一致[11]。巴馬亭、小檗堿、表小檗堿、黃連堿4種生物堿均為異喹啉生物堿，分子量分別為352、336、336、320 g/moL，分子量大小相似，不同的是結(jié)構(gòu)差異。對這2種試驗菌而言，可能亞甲氧基不利于細菌的生長，2，3位碳上亞甲氧基（R1+R2）的影響強于9，10位碳上的亞甲氧基（R3+R4）。從上述組分抑菌活性結(jié)果看，這4種組分彼此可能有協(xié)同抑菌的效果，也有可能這4種生物堿之外的微量組分有較強的抑菌活性。試驗中也對黃連總堿HSCCC分離4種生物堿以外的餾分進行活性測試，但結(jié)果較弱。

3? 小結(jié)與討論

黃連對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑菌效果強于革蘭氏陰性菌大腸桿菌，這與以往文獻報道一致。當(dāng)用不同溶劑提取時，黃連對2種試驗菌的抑菌活性大小順序為醇提物>50%醇提物>水提物;把黃連分成非生物堿、多糖、總堿時，發(fā)現(xiàn)這3種組分均有抑菌活性，其中總堿的抑菌活性最強，多糖的抗菌活性較弱。進一步將總堿分離得到4種主要生物堿，其中小檗堿和黃連堿對2種試驗菌的活性較強，并且4種主要生物堿之間可能存在協(xié)同抗菌關(guān)系。

黃連有抗菌活性，不同溶劑提取物抗菌活性不同，這也說明黃連用不同炮制方法時，其抗菌活性也不同。黃連對多種細菌均有抗菌作用，但細菌不同，其抗菌成分有差異，說明不同成分作用于細菌的機理時不一樣，但這都是體外試驗。中藥體內(nèi)抗菌機理是一個復(fù)雜過程，涉及很多微生物及受生物體內(nèi)環(huán)境的影響?，F(xiàn)在研究認為，中藥抗菌是對細菌、對機體多環(huán)節(jié)多途徑作用的綜合結(jié)果。少數(shù)中藥抗菌與其有效成分直接作用于菌體有關(guān)，而大多數(shù)中藥抗菌機理是激發(fā)生物體內(nèi)在的其他抗菌因素，以及降低細菌毒力或者減輕細菌對組織細胞的破壞作用等途徑起到抗菌作用。

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