李紅英 王曉輝 覃大吉 向極釬１，楊永康１，陳菲菲１，萬(wàn)海英１，周 敏２，朱 麟１

摘要：采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)湘鄂地區(qū)6個(gè)不同區(qū)域的野生三葉木通[Akebia trifoliata（Thunb.） Koidz.]進(jìn)行了遺傳多樣性研究。從50個(gè)隨機(jī)引物中篩選出10個(gè)條帶清晰、多態(tài)性明顯并且重復(fù)性好的引物，共擴(kuò)增出86條DNA片段，其中73條為多態(tài)性條帶，占總擴(kuò)增帶數(shù)的84.9%。利用NTSYS軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，以相似系數(shù)0.578為標(biāo)準(zhǔn)，可將所有品種分為3類(lèi)，第Ⅰ大類(lèi)包括恩施紅廟（紫色型）和湖南古丈（麻色型）;第Ⅱ類(lèi)包括建始花坪、巴東茶店子和宣恩椒園;恩施太陽(yáng)河的獨(dú)立分為第Ⅲ類(lèi)。

關(guān)鍵詞：三葉木通[Akebia trifoliata（Thunb.） Koidz.];野生資源;RAPD;親緣關(guān)系

中圖分類(lèi)號(hào)：Q37? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）23-0148-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.23.035? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

三葉木通[Akebia trifoliata（Thunb.） Koidz.]隸屬于木通科木通屬，俗稱(chēng)預(yù)知子、八月瓜，落葉藤木，長(zhǎng)可達(dá)10 m。多生長(zhǎng)于海拔350～1 600 m的山地、山坡、山谷、溪邊、密林或疏林灌叢較陰濕地。分布于長(zhǎng)江流域各省以及甘肅、河北等省。小枝褐色或暗褐色，疏生淡黃褐色皮孔;莖枝無(wú)毛。三葉復(fù)葉，小葉卵形，邊緣具波狀圓齒或淺裂，側(cè)脈一般5～6對(duì)，頂葉較小，基部偏斜?？偁罨ㄐ?，花單性，暗紫紅色。果為肉質(zhì)果，橢圓形，稍彎曲，種子多數(shù)，扁平卵圓形，黑色。花期5月，果期8—9月。本種果實(shí)含有糖類(lèi)，種子含脂肪油43%。根、藤莖及果實(shí)、種子均可入藥。種子可榨油;果實(shí)熟后可食用。

RAPD是美國(guó)的Williams與Welsh 2個(gè)研究小組于1990年同時(shí)提出的1種DNA分子標(biāo)記技術(shù)[1，2]。RAPD技術(shù)建立在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，用一系列（通常數(shù)百個(gè)）不同的隨機(jī)排列堿基序列的寡核苷酸單鏈（一般為8～10 bp）作為引物，對(duì)所研究的基因組DNA進(jìn)行單引物擴(kuò)增，然后用凝膠電泳分離擴(kuò)增片段，經(jīng)染色來(lái)顯示擴(kuò)增DNA片段的多態(tài)性，擴(kuò)增片段多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性[3]。相對(duì)于傳統(tǒng)的酶學(xué)、RFLP等方法，RAPD標(biāo)記具有操作快速、簡(jiǎn)便、多態(tài)性豐富、適應(yīng)性廣等諸多優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位，特別是遺傳多樣性的檢測(cè)[4]和品種分類(lèi)、親緣關(guān)系鑒定和病毒檢測(cè)、優(yōu)良性狀及抗體篩選等方面[5]。由于RAPD標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用隨機(jī)引物，當(dāng)對(duì)大量試驗(yàn)材料進(jìn)行研究時(shí)，往往首先要對(duì)引物進(jìn)行篩選[6]。為此，試驗(yàn)以湘鄂6個(gè)不同區(qū)域的三葉木通為材料，通過(guò)RAPD標(biāo)記技術(shù)對(duì)50個(gè)10堿基的隨機(jī)引物進(jìn)行篩選，以期為應(yīng)用RAPD標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行三葉木通的遺傳多樣性分析、品種分子鑒別、構(gòu)建遺傳指紋圖譜及分子標(biāo)記輔助育種等研究奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

1.1.1? 供試樣品? 供試樣品為2017年收集的湘鄂6個(gè)不同地區(qū)三葉木通類(lèi)群的鮮葉，具體信息見(jiàn)表1。

1.1.2? 主要儀器? 高壓蒸汽滅菌鍋（上海東亞容器01J2003-04）、超低溫冰箱（SANYO MDF-392）、冰箱（Hair 208K/ANCINA）、制冰機(jī)（SCOTSMAN DA24845-3）、PCR擴(kuò)增儀（德國(guó)Eppendorf 5331）;高速低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 5417R）、電泳儀（北京六一DYY-4C）、渦旋振蕩器（美國(guó)Scientific Industries Vortex-Genie 2）、電子天平（賽多利斯Secura？誖）、凝膠成像系儀器（美國(guó)伯樂(lè) Gel Doc 200）、超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析TU-1810）。

1.1.3? 引物及試劑? 試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的RAPD引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增所用試劑購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 基因組DNA的提取? 三葉木通DNA提取使用TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extration Kit。取葉片100 mg，液氮研磨后加入500 μL的Buffer HS I和10 μL的50×DTT Buffer混勻，然后加入10 μL的RNase A（10 mg/mL），充分振蕩混勻，于56 ℃水浴溫育10 min;加入62.5 μL的Buffer KAC（Buffer HS I或Buffer HS II的1/8體積），充分混勻，冰上放置5 min;12 000 r/min離心5 min，取上清，加入與上清液等體積的Buffer GB，充分混勻，將Spin Column安置于Collection Tube，溶液移至 Spin Column中（由于溶液較多，一般需要分兩次過(guò)柱，每次過(guò)柱的體積量不要超過(guò)700 μL），12 000? ? r/min離心1 min，棄濾液;將500 μL的Buffer WA加入至Spin Column中，12 000 r/min離心1 min，棄濾液;將700 μL的Buffer WB加入至Spin Column中，12 000 r/min離心1 min，棄濾液（沿Spin Column管壁四周加入Buffer WB，這樣有助于完全沖洗沾附于管壁上的鹽分）;重復(fù)上一個(gè)步驟;將Spin Column安置于Collection Tube上，12 000 r/min離心2 min;將Spin Column安置于新的1.5 mL的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入30～50 μL的Elution Buffer或滅菌水，室溫靜置5 min（將? Elution Buffer或滅菌水加熱至65 ℃時(shí)使用有利于提高洗脫效率）;12 000 r/min離心2 min洗脫DNA。用超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)和1.3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA樣品的純度與濃度。

1.2.2? RAPD PCR擴(kuò)增? 反應(yīng)體系總體積25 μL，含有1 μL基因組DNA（30 ng），1 μL引物（5 μmol/L），2.5 μL 10×PCR buffer反應(yīng)緩沖液，2 μL MgCl2（25 mmol/L），2 μL dNTP（2.5 mmol/L），0.2 μL Taq酶，用ddH2O補(bǔ)充體積至25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，35.5 ℃退火1 mins，72 ℃延伸1 min，38個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.3%的瓊脂糖凝膠電泳分離，電壓110 V，電泳35 min，在凝膠成像儀上觀察照相、記錄。

1.3? 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)各分子在相同電泳遷移率（相同分子量片段）的有無(wú)，統(tǒng)計(jì)得到所有條帶的二元數(shù)據(jù)，有DNA擴(kuò)增條帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”，利用Ntsys計(jì)算出遺傳相似系數(shù)、構(gòu)建聚類(lèi)圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 三葉木通基因組DNA的提取結(jié)果

由圖1可知，提取的DNA經(jīng)1.3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶清晰，表明DNA質(zhì)量滿(mǎn)足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

2.2? 引物擴(kuò)增結(jié)果

進(jìn)行引物的篩選也是進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵，本試驗(yàn)選取了上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成的50種隨機(jī)引物進(jìn)行篩選，在合適的PCR擴(kuò)增條件下，一些引物如M04、S07、S08、S15、S16無(wú)擴(kuò)增條帶，而S11、S13、S29、S32、S40、S43、S44、S47、S49、S50擴(kuò)增譜帶清晰且多態(tài)性好擴(kuò)增范圍廣泛，都在7條帶及以上，所以選取這10種引物用于親緣關(guān)系分析（表2）。

2.3? 親緣關(guān)系分析

在建立合適的RAPD反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，從50個(gè)10 bp隨機(jī)引物中選用最好的引物S11、S13、S29、S32、S40、S43、S44、S47、S49、S50用于正式擴(kuò)增，對(duì)6個(gè)供試的三葉木通葉片基因組DNA擴(kuò)增出10張指紋圖譜，共獲得86條DNA譜帶，其中73條多態(tài)性帶，占總擴(kuò)增帶數(shù)的84.9%，每個(gè)引物擴(kuò)增的帶數(shù)在7～11條，平均為8.6條，擴(kuò)增出的DNA片段大小在100～1 000 bp，表3為所選的10種引物擴(kuò)增結(jié)果。

圖2至圖11為引物S11、S13、S29、S32、S40、S43、S44、S47、S49、S50的RAPD擴(kuò)增圖譜。10個(gè)指紋圖譜綜合分析結(jié)果表明，湖南古丈與恩施太陽(yáng)河、宣恩椒園的共同點(diǎn)位很少，擴(kuò)增的條帶少，它們的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而恩施紅廟與湖南古丈、建始花坪與巴東茶店子的擴(kuò)增帶的相似性很大且譜帶清晰，所擴(kuò)增的片段都在100～1 000 bp，它們的親緣關(guān)系較近。

2.4? 遺傳相似性分析

利用RAPD標(biāo)記擴(kuò)增DNA片段，通過(guò)Ntsys計(jì)算出遺傳相似系數(shù)（GS）。RAPD標(biāo)記揭示的6個(gè)地區(qū)三葉木通資源間的遺傳相似系數(shù)為0.434 1～0.682 9（表4），平均值為0.558 5。其中建始花坪（JS）與巴東茶店子（BD）GS值最大，為0.682 9，湖南古丈（HN）與恩施太陽(yáng)河（TYH）GS最小，為0.434 1。

2.5? 聚類(lèi)結(jié)果分析

由圖12可知，以相似系數(shù)0.578為標(biāo)準(zhǔn)，可將6個(gè)不同區(qū)域的三葉木通分為3大類(lèi)，第Ⅰ大類(lèi)包括恩施紅廟自選品種紫色型（ES）和湖南古丈麻色型（HN），它們之間的基因組差異不是很明顯，這很可能是由于自選品種恩施紅廟紫色型多年來(lái)對(duì)湖南古丈三葉木通進(jìn)行的品種選育和野轉(zhuǎn)家栽培造成的;第Ⅱ類(lèi)包括宣恩椒園（XE）、巴東茶店子（BD）和建始花坪（JS）;恩施太陽(yáng)河（TYH）獨(dú)立分為一類(lèi)。

3? 小結(jié)

RAPD標(biāo)記技術(shù)是出現(xiàn)最早的分子標(biāo)記技術(shù)之一，其操作簡(jiǎn)便、成本較低及不需要DNA的序列材料等特點(diǎn)是其他標(biāo)記技術(shù)無(wú)法比擬的[7]。但RAPD標(biāo)記也存在某些不足，其中最主要的是其靈敏度高，受反應(yīng)條件影響較大，檢測(cè)的重復(fù)性較差，因此，研究者在利用RAPD標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性分析時(shí)一定要嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件，采用穩(wěn)定優(yōu)化的反應(yīng)體系方能取得理想的試驗(yàn)結(jié)果[8]。同時(shí)，在運(yùn)用RAPD標(biāo)記技術(shù)時(shí)，由于每個(gè)隨機(jī)引物并不適合于所有物種，因此對(duì)引物的篩選是非常必要的，篩選出多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好的隨機(jī)引物是整個(gè)試驗(yàn)成功的關(guān)鍵[9]。

田宗城等[10]以七葉木桶、三葉木通、白木通、五葉木通等4個(gè)種的12個(gè)材料為研究對(duì)象，用RAPD技術(shù)對(duì)其進(jìn)行親緣關(guān)系分析，從40個(gè)隨機(jī)引物（10mer）中篩選出5個(gè)（S30、S168、S11、S12、S96），對(duì)所有供試材料進(jìn)行擴(kuò)增，共獲得5張指紋圖譜，共在52個(gè)位點(diǎn)上擴(kuò)增出條帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增10.4個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)43個(gè)，占總帶數(shù)的82.7%。而本試驗(yàn)以湘鄂地區(qū)6個(gè)不同區(qū)域的三葉木通為供試材料，更為系統(tǒng)地分析了三葉木通遺傳多樣性，從50個(gè)隨機(jī)的RAPD引物中成功篩選出10條多態(tài)性豐富、條帶清晰且可重復(fù)性好的有效引物，10條引物共擴(kuò)增出83條DNA條帶，其中84.9%為多態(tài)性條帶，這為應(yīng)用RAPD標(biāo)記技術(shù)快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行三葉木通遺傳多樣性分析和品種分子鑒別等研究奠定了良好基礎(chǔ)。

三葉木通分布于中國(guó)河北、山西、山東、河南、陜西南部、甘肅東南部至長(zhǎng)江流域各省區(qū)?？梢?jiàn)它分布遍布全國(guó)各地，樣品采集應(yīng)該來(lái)源于全國(guó)各地，而試驗(yàn)不足之處在于樣品采集的局限性，只收集了鄂湘6個(gè)不同區(qū)域，對(duì)三葉木通遺傳多樣性的研究不是很全面，但是卻為三葉木通種子資源的篩選與開(kāi)發(fā)利用奠定了一定的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] WILLIAMS J G K，KUBELIK A R，LIVAK K J，et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J].Nucleic Acids Research，1990，18（22）：6531-6535.

[2] WELSH J，HONEYCUTT R J，MCCLELLAND M，et al. Parentage determination in maize hybrids using the arbitrarily primed polymerase chain reaction（AP-PCR）[J].Theor Appl Genet，1991， 82：473-476.

[3] 陳名紅，熊華斌，李成云.分子標(biāo)記在百合屬植物遺傳多樣性研究中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報(bào)，2011（12）：65-69.

[4] 趙? 錦，劉? 孟，呂增仁，等.RAPD技術(shù)在植物遺傳多樣性研究中的應(yīng)用[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，23（1）：25-28.

[5] 鄒喻萍.系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)中的分子標(biāo)記[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[6] CHARLES J S，F(xiàn)RED J M. A quick and versatile method for plant DNA extraction from small amounts of tissue[J].Nucleic Acids Res，1990，18：6531-6535.

[7] 周? 娟，羅? 育，吳耀生，等.8份廣西產(chǎn)絞股藍(lán)種質(zhì)的RAPD引物篩選及其遺傳多樣性分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010， 29（2）：273-278.

[8] 張美勇，上官凌飛，徐? 穎，等.核桃RAPD引物篩選及品種間親緣關(guān)系研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（2）：84-90.

[9] 何慶元，玉永雄，王松華，等.根瘤菌RAPD引物篩選及條件優(yōu)化[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2007，21（2）：132-135.

[10] 田宗城，李? 峰，王文龍，等.木通屬植物的RAPD研究[J].湖南文理學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，17（2）：40-42.