趙 軍，徐志文，2，朱 玲，2，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130)

PRRSV是單股正鏈RNA病毒，屬尼多病毒目動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)、動(dòng)脈炎病毒屬(Arterivirus)。其基因組全長約15.4 kb，包含10個(gè)ORFs，分別為ORF1a、1b、2a、2b以及ORF3- 5、ORF5a、ORF6- 7。ORF1a在病毒復(fù)制中，先被翻譯成ppla多聚蛋白，ORF1b通過核糖體轉(zhuǎn)移碼轉(zhuǎn)移成pplab多聚蛋白。之后分別被水解為Nsp1- 8和Nsp9- 12等至少16種非結(jié)構(gòu)蛋白[1-3]。PRRSV感染早期Nsp1β、Nsp2、Nsp4、Nsp7α、Nsp7β、Nsp8定位于細(xì)胞核周圍，原位標(biāo)記顯示它們共定位的位置為病毒RNA復(fù)制場所[4]。

Nsp2基因是PRRSV遺傳流行病學(xué)監(jiān)測和演化的重要基因，當(dāng)前PRRSV多亞型毒株在Nsp2基因區(qū)段均有不同程度的基因插入和缺失。所以關(guān)于Nsp2蛋白與PRRSV毒力、致病性的關(guān)系、對細(xì)胞的侵襲能力的研究越來越多，也越來越深入。Nsp2是PRRSV最大的復(fù)制蛋白，其基因長度約為2.9 kb，不同毒株序列之間變異明顯且基因全長不一。Nsp2保守性最差，美洲型毒株和歐洲型毒株序列比對顯示，氨基酸序列同源性僅為32%，抗原表位眾多，而表位集中區(qū)域容易發(fā)生基因變異。

目前已鑒定Nsp2有4個(gè)主要功能區(qū)：N端的半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(PL2)；功能尚未清楚的中間高變區(qū)；近C端的高親水性跨膜區(qū)；功能尚不明確的C端富含半胱氨酸殘基保守區(qū)。Nsp2蛋白具有順式和反式2種酶切活性，所以酶切后能夠產(chǎn)生7種Nsp2亞型(Nsp2a、Nsp2b、Nsp2c、Nsp2d、Nsp2e、Nsp2f、Nsp2TF)。其中Nsp2TF是最近發(fā)現(xiàn)的能影響PRRSV復(fù)制的新亞型(約占Nsp2的2/3)。這些Nsp2使用相同的N末端和不同的C末端[3,5]。Nsp2是一個(gè)與病毒相關(guān)的PRRSV蛋白，研究表明PRRSV的復(fù)制過程中會(huì)出現(xiàn)大小不一的Nsp2亞類，它們共享PL2區(qū)域的227個(gè)氨基酸的N端。產(chǎn)生的這些不同分子量的Nsp2可能存在不同的功能，大分子Nsp2亞型蛋白在感染早期出現(xiàn)，對病毒的早期復(fù)制可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用[6-7]。Nsp2以多個(gè)亞型存在于病毒包膜上，在病毒包裝時(shí)與病毒的包膜融合有關(guān)，還存在于細(xì)胞突起上，與細(xì)胞之間的聯(lián)系密切相關(guān)，其所誘導(dǎo)的體液免疫所產(chǎn)生的抗體與結(jié)構(gòu)蛋白N蛋白形成的免疫水平相當(dāng)。其N末端具有保守的催化N末端半胱氨酸和組氨酸殘基的活性，并被認(rèn)為具有半胱氨酸蛋白酶的活性[8]。此外，Nsp2還是Nsp4絲氨酸蛋白酶的輔助因子，與細(xì)胞和組織嗜性有關(guān)，在病毒復(fù)制過程中，參與多聚蛋白的裝配[9]。

當(dāng)前，PRRS對養(yǎng)豬業(yè)造成的沖擊正逐漸加重，特別是2013年以后國內(nèi)多地相繼報(bào)道發(fā)現(xiàn)Nsp2缺失131aa的NADC30類似毒株，使得國內(nèi)PRRSV的防控變得更加復(fù)雜。Nsp2是不同亞型毒株之間變異最明顯也最沒有規(guī)律的蛋白，當(dāng)前對地區(qū)PRRSV的流行病學(xué)調(diào)查及毒株遺傳進(jìn)化分析多以Nsp2基因?yàn)榘谢颉，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，當(dāng)前NADC30類似毒株多發(fā)現(xiàn)于河北、河南、山東、遼寧等省，南方地區(qū)還未見報(bào)道，但基于當(dāng)前交通便利、生豬流動(dòng)大等現(xiàn)狀，NADC30類似毒株何時(shí)能傳入南方，能造成多大困擾還未可知。因此，針對新流行毒株的檢測及其變異后的Nsp2在病毒復(fù)制、致病力和參與免疫調(diào)控方面的研究是很有必要的。

1 Nsp2的高變異性

Nsp2在非結(jié)構(gòu)蛋白中變異性最大，點(diǎn)突變、插入和缺失是PRRSV Nsp2的常見突變。對中國的PRRSV進(jìn)行調(diào)查分析，Nsp2基因具有廣泛的變異性[10]。2006年，我國爆發(fā)了高致病性PRRS(HP- PRRS)，2008年，美國報(bào)道發(fā)現(xiàn)一種新亞型的HP- PRRSV(NADC30)，通過Nsp2的基因序列比較結(jié)果顯示，HP- PRRSV和經(jīng)典PRRSV比較在Nsp2高變區(qū)存在30 aa左右的連續(xù)缺失[11]，而NADC30類型毒株較HP- PRRSV在Nsp2高變區(qū)存在131 aa左右的不連續(xù)缺失[12-14]，從GenBank中收錄的HP- PRRSV、經(jīng)典PRRSV、NADC30類型毒株遺傳進(jìn)化樹分析顯示，NADC30毒株與國內(nèi)主流毒株HP- PRRSV、經(jīng)典PRRSV分屬2個(gè)大的分支，而HP- PRRSV、經(jīng)典PRRSV屬于同一進(jìn)化分支(圖1)。

野毒株自然缺失時(shí)有報(bào)道：本實(shí)驗(yàn)室毛汐語等[15]2012年分離的SC2012自然減毒株，在aa485～aa498區(qū)間連續(xù)缺失14個(gè)氨基酸；Gao等[16]首次報(bào)導(dǎo)了PRRSV Nsp2天然缺失的病毒株HB- 2(SH)/2002，在aa471～aa482區(qū)間連續(xù)缺失12個(gè)氨基酸；Liu等[17]分離的2株歐洲型PRRSV在Nsp2的aa282～aa348區(qū)間連續(xù)缺失68個(gè)氨基酸，同時(shí)還分離出4株北美型PRRSV在aa322～aa432、aa483、aa504～aa522區(qū)間連續(xù)缺失31個(gè)氨基酸[18]；Ji等[19]分離的GZgy15- 1毒株在Nsp2的aa488～aa516區(qū)間缺失29個(gè)氨基酸。另外還發(fā)現(xiàn)，在FJLYDX04株的aa599～aa603序列中有5個(gè)堿基的插入，這是中國第一株報(bào)道Nsp2存在插入的病毒株[20]。此外，病毒株HZ- 31的Nsp2區(qū)含有59個(gè)不連續(xù)缺失，分別為aa467～aa474、aa498～aa519和aa533～aa361，但它的481位未像其他HP- PRRSV株一樣缺失，在遺傳系統(tǒng)中分析，它是獨(dú)立于JXA1和EM2007的一個(gè)單獨(dú)分支[21]。

表1分離株Nsp2變異情況

Table1Nsp2 variation of isolated strains

毒株Strain分離年限Isolationtime分離國家Isolationcountry氨基酸缺失(插入)Aminoaciddeletion(insertion)突變位點(diǎn)Positionrelativetocomparedstrain參考毒株ReferencePRRSVstrain基因類型Genotype登錄號(hào)AccessionNo.HB-2(SH)/20022002China12aa471～482VR-2332NorthAmerican-JXA12006China1aa,29aa483,504～522VR-2332NorthAmericanEF112445GDQY22007China35aa,29aa470～505,532～560VR-2332NorthAmericanGU454850Em20072007China68aa499～566VR-2332NorthAmericanEU262603SC20122012China14aa485～498JXA1NorthAmericanKM189443NADC302011China131aa—JXA1NorthAmericanJN654459HENAN-XINX2013China131aa303,323～433,501～519JXA1NorthAmericanKF611905HZ-312013China8aa,22aa,29aa467～474,498～519,533～561JXA1NorthAmericanKC445138GZgy15-12015China29aa488～516JXA1NorthAmericanKT358728CHsx14012015China111aa323～433JXA1NorthAmericanKP86162515LY02-FJ2015China11aa322～432,483,504～522JXA1NorthAmericanKU215417HNhx2016China111aa,1aa,19aa323～433,483,501～519JXA1NorthAmericanKX766379FJQEU142014China68aa282～348LVEuropeanKP860913

圖1 不同基因類型遺傳進(jìn)化分析Fig.1 Genetic evolution analysis of different gene types

2 Nsp2與PRRSV毒力

從經(jīng)典PRRSV、HP- PRRSV和NADC30類PRRSV的Nsp2變異的情況分析，研究人員們一直懷疑Nsp2的氨基酸缺失導(dǎo)致了HP- PRRSV毒力的增強(qiáng)，但是現(xiàn)已通過多個(gè)強(qiáng)、弱毒株基因片段置換試驗(yàn)證明其與毒力并無關(guān)聯(lián)。Zhou等[22]在HP- PRRSV反向遺傳操作平臺(tái)的基礎(chǔ)上通過分別置換強(qiáng)毒株JXwn6和弱毒株HB- 1/3.9的相對應(yīng)的Nsp2區(qū)域，然后恢復(fù)病毒測定病毒的致病力，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，互相置換了Nsp2相應(yīng)區(qū)域的恢復(fù)毒株與親本株的致病力無異。

Li等[23]在HP- PRRSV反向遺傳操作平臺(tái)的基礎(chǔ)上通過分別置換強(qiáng)毒株JXwn6和弱毒株HB- 1/3.9的5’UTR+ORF1a和ORF1b以及M和N蛋白，然后恢復(fù)病毒測定病毒致病力，結(jié)果表明置換ORF1a的恢復(fù)病毒不管是強(qiáng)毒株還是弱毒株，毒力沒有相應(yīng)減弱或增強(qiáng)。這2個(gè)試驗(yàn)充分表明HP- PRRSV的Nsp2連續(xù)缺失30 aa并不是其毒力增強(qiáng)的主要原因。

3 Nsp2與PRRSV復(fù)制

病毒的復(fù)制有時(shí)需要利用宿主蛋白，但是自身的一些非結(jié)構(gòu)蛋白也會(huì)參與病毒的復(fù)制過程。PRRSV是正鏈RNA病毒，復(fù)制過程在細(xì)胞質(zhì)靠近細(xì)胞核的雙層囊泡中進(jìn)行，而對Nsp2的亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示其定位于細(xì)胞核周圍，與雙層囊泡的位置相一致，是病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵區(qū)域[24]。王鳳雪等[25]通過將HP- PRRSV弱毒株TJM株的Nsp2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到Marc- 145細(xì)胞中，建立了穩(wěn)定表達(dá)Nsp2蛋白的細(xì)胞系，通過接種病毒測定病毒含量發(fā)現(xiàn)Nsp2蛋白能夠促進(jìn)PRRSV的增殖。在對Nsp2影響PRRSV復(fù)制的深入研究中發(fā)現(xiàn)，Nsp2的aa323～aa433和aa628～aa747雖不是PRRSV復(fù)制的關(guān)鍵位點(diǎn)，但在PRRSV復(fù)制過程中起到了重要的作用[26]。進(jìn)一步通過截?cái)嗟鞍姿矔r(shí)表達(dá)的方式探索Nsp2中缺失的氨基酸與PRRSV復(fù)制是否有關(guān)，發(fā)現(xiàn)TJM株Nsp2中缺失的120 aa中的aa628～aa727能夠抑制病毒的增殖[27]。在對Nsp2的N端的半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(PL2)和功能尚不明確的C端富含半胱氨酸殘基保守區(qū)病毒復(fù)制的影響的試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在C末端插入EGFP蛋白并不能對病毒的復(fù)制造成影響，EGFP蛋白能正常表達(dá)，但是對N端的研究表明，PL2的反向切割活性在病毒復(fù)制過程中是非常重要的。進(jìn)一步對其精確的位點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn)，PL2的核心域(aa47～aa180)和直接下游區(qū)域(aa181～aa323)是病毒復(fù)制必不可少的[28-29]。

除Nsp2直接影響病毒的復(fù)制以外，還存在其他途徑影響病毒增殖，細(xì)胞中的一些蛋白質(zhì)也能通過與Nsp2互作來影響PRRSV的復(fù)制，Nsp2招募Bcl2相關(guān)抗凋亡基因6(BAG6)蛋白并利用該蛋白幫助NSP2定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)促進(jìn)雙層膜泡的形成[30]。細(xì)胞中的14- 3- 3蛋白家族是常見的蛋白家族，通過激光共聚焦和過表達(dá)最終確定14- 3- 3蛋白能夠作用Nsp2促進(jìn)PRRSV的增殖[31]。Nsp2利用N端的半胱氨酸蛋白酶的去泛素化酶活性抑制凋亡誘導(dǎo)分子1(AIF1)的泛素化降解，從而促進(jìn)PRRSV復(fù)制過程中胞內(nèi)ATP的合成[32]。同時(shí)也有研究表明病毒復(fù)制過程中自身產(chǎn)生的miRNA(微小核糖核酸)能夠直接靶向Nsp2基因來抑制病毒的增殖，形成負(fù)調(diào)控[33]。

總之，通過由簡到繁、由全蛋白到關(guān)鍵位點(diǎn)的對Nsp2影響、參與病毒復(fù)制的研究表明，Nsp2的高變區(qū)域依舊有一些關(guān)鍵位點(diǎn)能夠影響病毒的復(fù)制，其N- 末端和C- 末端的一部分區(qū)域在病毒復(fù)制過程中是至關(guān)重要的。

4 Nsp2與免疫調(diào)控

Nsp2蛋白是病毒蛋白中最大的蛋白，它參與多肽的組合和病毒的復(fù)制等復(fù)雜的過程，并富含抗原表位[34]。近年來，關(guān)于PRRSV對豬免疫抑制的報(bào)道主要集中在對各種細(xì)胞因子的抑制及促進(jìn)方面，以間接反映宿主免疫反應(yīng)情況。Beura等[35]發(fā)現(xiàn)，PRRSV的4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白對IFN- β啟動(dòng)子(IRF- 3)的活性起到有效的抑制作用。依據(jù)它們的影響大小，排序?yàn)镹sp1、Nsp2、Nsp11和Nsp4。Li等[36]證明，Nsp2通過抵抗IFN調(diào)節(jié)因子3(IRF- 3)的活性進(jìn)而強(qiáng)烈地抑制由仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)的IFN- β產(chǎn)生。有研究顯示，Nsp2蛋白在PRRSV感染細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)分布，并與RIG- I信號(hào)通路中的一個(gè)銜接分子MAVS和能夠激活細(xì)胞內(nèi)I型IFN信號(hào)通路的信號(hào)分子LSml4A共定位，但不影響IRF- 3或NF- κB入核，表明PRRSV對先天免疫的影響可能在細(xì)胞核內(nèi)[6]。Sun等[37]證明，Nsp2的卵巢腫瘤蛋白酶(OTU)區(qū)域具有泛素連接酶活性，這個(gè)區(qū)域可以通過對IκBα聚泛素化而抑制IκBα的降解，而IκBα是NF- κB的抑制因子，從而抑制NF- κB的活性而抑制IFN- I的產(chǎn)生。而Fang等[38]證明，PRRSV WUH3株Nsp2蛋白的過量表達(dá)能夠誘導(dǎo)IκBα降解，激活NF- κB。并且確定了Nsp2的高變區(qū)(aa179～aa782)對于激活NF- κB是不可缺少的，并且它所刺激的活性與Nsp2全長基本一致。非結(jié)構(gòu)蛋白還可以誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN- γ和IL- 10。Burgara- Estrella等[39]通過動(dòng)物試驗(yàn)確定PRRSV Nsp2的非保守多肽(589SLYKLLLEV597)可以引起豬的免疫反應(yīng)，并產(chǎn)生IFN- γ。Xing等[26]通過缺失多株P(guān)RRSV Nsp2高變區(qū)的片段研究其對機(jī)體免疫誘導(dǎo)的影響，發(fā)現(xiàn)缺失aa322～aa434、aa531～aa561和aa531～aa561、aa627～aa748的恢復(fù)毒株誘導(dǎo)IL- 1β、IL- 6和TNF- α的能力降低，但aa531～aa561、aa627～aa748缺失株卻能強(qiáng)烈誘導(dǎo)IL- 12(P40)的表達(dá)。

5 Nsp2的可插入位點(diǎn)與分子標(biāo)簽

Nsp2的非必需區(qū)域能夠插入表達(dá)外源蛋白，目前關(guān)于對Nsp2插入外源蛋白的位點(diǎn)和外源蛋白的種類做了很多的研究。同時(shí)由于Nsp2的高突變導(dǎo)致其不同亞型之間插入和缺失突變非常嚴(yán)重，能夠利用其毒株之間的插入和缺失來區(qū)分毒株亞型，同樣也起到分子標(biāo)簽的作用[40]。

Kim等[41]通過在Nsp2非關(guān)鍵區(qū)進(jìn)行缺失并插入肽標(biāo)簽，發(fā)現(xiàn)拯救病毒株毒力顯著降低，并能被特異抗原包被的ELISA試劑盒檢測，再次驗(yàn)證了Nsp2是用來發(fā)展標(biāo)記疫苗和弱毒苗的潛在靶基因。Xu等[42]在對疫苗毒HuN4- F112 Nsp2復(fù)制非關(guān)鍵區(qū)缺失25個(gè)氨基酸，并插入新城疫病毒N蛋白免疫顯性B細(xì)胞表位49個(gè)氨基酸作為一種基因標(biāo)記疫苗，在動(dòng)物體內(nèi)能同時(shí)產(chǎn)生對抗NDV NP及PRRSV的特異性抗體，而且缺乏針對缺失的25個(gè)氨基酸的抗體，免疫豬獲得很好的免疫保護(hù)，該疫苗可以作為一種有效的對抗PRRSV的基因標(biāo)記苗。

Yu等[43]利用反向遺傳操作平臺(tái)將豬的粒細(xì)胞- 巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM- CSF)插入到HuN- F112的ORF1b與ORF2a之間作為分子標(biāo)記，后續(xù)試驗(yàn)表明GM- CSF能夠穩(wěn)定地隨著病毒復(fù)制而表達(dá)，說明在這一區(qū)域能夠允許外源蛋白的插入。

6 展望

隨著對PRRSV Nsp2蛋白的深入研究，Nsp2在病毒復(fù)制、致病性、機(jī)體相互作用方面的作用也越來越清晰。Nsp2基因在不同亞型中的特征性變異，為PRRSV變異亞型的鑒定提供依據(jù)，同時(shí)，這些研究也揭示了Nsp2氨基酸的變異不是PRRSV的毒力改變的主要因素，但是Nsp2蛋白在PRRSV的復(fù)制、免疫調(diào)控等方面扮演著重要的角色。Nsp2 能夠直接影響病毒的復(fù)制，并且Nsp2也能通過與細(xì)胞中的一些蛋白質(zhì)互作來影響PRRSV的復(fù)制。Nsp2對IFN- β啟動(dòng)子(IRF- 3)的活性起到有效的抑制作用，從而抑制病毒誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生IFN- β。Nsp2的卵巢腫瘤蛋白酶(OUT)區(qū)域可以通過對IκBα聚泛素化而抑制IκBα的降解，從而抑制NF- κB的活性而抑制IFN- I的產(chǎn)生。Nsp2的高變區(qū)(aa179～aa782)對于激活NF- κB是不可缺少的。同時(shí)，Nsp2非必需區(qū)域的高變性為PRRSV作為載體插入外源蛋白和分子標(biāo)簽提供了可能。對Nsp2蛋白的功能研究有助于闡明PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白參與免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)Nsp2蛋白的遺傳變異研究有助于相關(guān)重組疫苗的研究和分子標(biāo)簽的應(yīng)用，為疫苗株和野毒株的鑒定提供參照。

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