王巧利，王俊剛*，申 紅，張玉棟，閆文靜

(1.石河子大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子832000；2.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子832000)

病原微生物常會(huì)引起人類和動(dòng)物發(fā)生腹瀉，應(yīng)用藥物治療該病是目前的主要手段。但隨著抗生素的濫用，多種病原菌產(chǎn)生了耐藥性，給腹瀉治療造成了困擾。為了解決這個(gè)問題，學(xué)者開始研究藥用昆蟲，致力于尋找能夠替代抗生素治療動(dòng)物腹瀉的天然藥物。

美洲大蠊(Periplaneta americanaL.)為了防御病原微生物，進(jìn)化出特殊免疫機(jī)制，體內(nèi)富含多種生物活性物質(zhì)，為其藥用開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。研究顯示，以美洲大蠊為原料生產(chǎn)的“康復(fù)新”可以治療十二指腸潰瘍及其它消化系統(tǒng)疾病[1]；藍(lán)江林等分離出的美洲大蠊體內(nèi)活性物質(zhì)能夠明顯抑制細(xì)菌生長(zhǎng)[2]；周瓊等用美洲大蠊粉給小鼠灌胃，發(fā)現(xiàn)其具有提高小鼠抗腹瀉的作用[3]；張細(xì)元等在研究腹瀉病患兒中發(fā)現(xiàn)腹瀉引起結(jié)腸內(nèi)酶活性在治療前后有差異[4]；動(dòng)物腸道病原微生物群落和數(shù)量也因攝入的食物不同而發(fā)生變化[5]。

基于此，本研究以腹瀉小鼠為模型，在飼料中添加美洲大蠊粉進(jìn)行治療，研究腹瀉小鼠結(jié)腸內(nèi)菌群和大腸桿菌的數(shù)量變化，探究飼喂美洲大蠊粉對(duì)小鼠結(jié)腸酶系的影響，為美洲大蠊粉進(jìn)一步藥用開發(fā)與利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 健康昆明雄性小鼠及小鼠基礎(chǔ)飼料，均由石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供。美洲大蠊飼養(yǎng)于石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院生物防治實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)用的美洲大蠊粉是將美洲大蠊低溫處死，用流動(dòng)水洗掉其表面雜物，在55℃烘干至恒重，粉碎備用，其顆粒直徑為5μm～8μm。

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GSH)、乙酰膽堿酯酶(ACHE)、酸性磷酸酶(ACP)、乳酸脫氫酶(LDH)、淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)檢測(cè)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基均參照文獻(xiàn)[6]配置。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)在石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院生防實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。測(cè)試期為22 d，適應(yīng)期7 d，建立腹瀉模型為5 d，治療期10 d。選取體質(zhì)量為20±2 g健康昆明雄性小鼠，待其適應(yīng)一周后，按體質(zhì)量相近隨機(jī)分組，空白組10只，建模組40只。建模組小鼠經(jīng)腹腔注射0.02 mL/g(3×108cfu)ATCC 43255大腸桿菌菌懸液，空白組小鼠注射等劑量無菌生理鹽水。建模成功后，將建模組再次分為模型組和治療組，治療組分別添加美洲大蠊粉高劑量組(8 %)、中劑量組(5 %)和低劑量組(2.5 %)，而空白組、模型組飼喂未添加美洲大蠊粉的同等量飼料，10只/組，5只/籠。1 d～5 d為建立腹瀉模型期(沒有添加美洲大蠊粉)，6 d～15 d為治療期(添加美洲大蠊粉)。小鼠投喂飼料是55 g/籠/d，給水150 mL/籠/d，連續(xù)飼喂10 d。

1.3 小鼠生理生化指標(biāo)的測(cè)定 小鼠投喂飼料后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d的下午(16∶00～18∶00)觀察并記錄每組每只小鼠2 h內(nèi)排稀便數(shù)和排便總數(shù)，計(jì)算稀便率(%)=稀便數(shù)/排便總數(shù)×100 %。試驗(yàn)結(jié)束后，脫臼法迫殺小鼠，取其結(jié)腸組織和結(jié)腸內(nèi)容物于無菌的EP管中，置-20℃?zhèn)溆?。按照各試劑盒操作說明測(cè)定結(jié)腸中的SOD、POD、CAT、GSH、ACHE、ACP、LDH、AMS、LPS的吸光度值(OD)；采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定其大腸桿菌和總菌數(shù)。伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基配制及大腸桿菌和總菌數(shù)的計(jì)數(shù)方法參照實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，采用伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基分別檢測(cè)結(jié)腸內(nèi)容物中大腸桿菌和總菌的數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行處理，采用One-Way ANOVA分析，采用多重比較LDS法，p＜0.05為顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 美洲大蠊粉對(duì)小鼠稀便率(%)的影響 小鼠經(jīng)腹腔注射大腸桿菌菌懸液建模，在建模期間(1 d～5 d)，小鼠稀便率顯著增加(p＜0.05)。建模成功后，分別以不同劑量的美洲大蠊粉治療腹瀉小鼠，隨著治療時(shí)間的增加，與模型組相比，美洲大蠊粉各劑量組小鼠的稀便率逐漸減弱，高劑量組的療效顯著高于中、低劑量組(p＜0.05)；美洲大蠊粉各劑量組間小鼠稀便率顯著低于模型組(p＜0.05)。隨著治療時(shí)間的增加，與模型組相比，美洲大蠊粉各劑量組的稀便率逐漸降低，高劑量組的療效顯著高于中、低劑量組(圖1)。表明美洲大蠊粉能減弱腹瀉小鼠的稀便率，增加機(jī)體抗腹瀉的能力。

圖1 美洲大蠊粉對(duì)腹瀉小鼠稀便率(%)的影響Fig.1 The effects of P.americana powder on defecation rate of diarrhea model mice(%)

2.2 美洲大蠊粉對(duì)腹瀉小鼠結(jié)腸抗氧化能力(SOD、POD、CAT)的影響 建模成功后，分別以不同劑量的美洲大蠊粉治療腹瀉小鼠，試驗(yàn)結(jié)束后取其結(jié)腸組織和結(jié)腸內(nèi)容物，采用試劑盒測(cè)定各組小鼠結(jié)腸SOD、POD、CAT活性。結(jié)果顯示，在飼喂美洲大蠊粉10 d后，小鼠結(jié)腸中SOD、POD、CAT顯著增高，且高劑量組顯著高于中、低劑量組(p＜0.05)。與空白組相比，模型組小鼠結(jié)腸的SOD、POD、CAT顯著降低(p＜0.05)；其中高劑量組小鼠的SOD、POD變化不明顯(p＞0.05)，但CAT顯著提高(p＜0.05)，低劑量組小鼠的SOD、POD顯著降低(p＜0.05)，但其CAT變化不明顯(p＞0.05)。與模型組相比，高劑量組小鼠的SOD、POD、CAT顯著增加(p＜0.05)，低劑量組小鼠的SOD、POD和中劑量組的SOD增加不明顯(p＞0.05)，而低劑量組小鼠的CAT顯著增加(p＜0.05)；高劑量組小鼠的SOD、CAT增加顯著高于中、低劑量組(p＜0.05)；中、低劑量組間小鼠的SOD、CAT無顯著差異(p＞0.05)；高劑量組小鼠POD活性顯著高于低劑量組(p＜0.05)；中劑量組與高劑量組和低劑量組小鼠的POD無顯著差異(p＞0.05)(圖2)。表明美洲大蠊粉能夠增加腹瀉小鼠結(jié)腸保護(hù)酶(SOD、POD、CAT)在腹瀉小鼠體內(nèi)的抗氧化能力。

圖2 美洲大蠊粉對(duì)腹瀉小鼠結(jié)腸SOD、POD、CAT的影響Fig.2 Effects of P.americana powder to GSH,ACHE and ACP in colon of diarrhea mice

2.3 美洲大蠊粉對(duì)腹瀉小鼠結(jié)腸解毒代謝能力(GSH、ACHE、ACP)的影響 建模成功后，分別以不同劑量的美洲大蠊粉治療腹瀉小鼠，試驗(yàn)結(jié)束后取其結(jié)腸組織和結(jié)腸內(nèi)容，采用試劑盒測(cè)定各組小鼠結(jié)腸GSH、ACHE、ACP活性。結(jié)果顯示，在飼喂美洲大蠊粉10 d后，小鼠結(jié)腸中的GSH、ACHE、ACP顯著增高(p＜0.05)，且高劑量組顯著高于低劑量組(p＜0.05)。模型組與空白組相比，小鼠的GSH、ACHE、ACP顯著降低(p＜0.05)。與空白組相比，高、中劑量組小鼠的ACHE、ACP差異不顯著(p＞0.05)，低劑量組小鼠的ACHE、ACP和高、中、低劑量組小鼠的GSH顯著降低(p＜0.05)；與模型組相比，低劑量組小鼠的ACP差異不顯著(p＞0.05)，高、中劑量組小鼠的ACP和高、中、低劑量組小鼠的GSH、ACHE顯著升高(p＜0.05)；高劑量組小鼠的GSH、ACHE、ACP顯著高于低劑量組(p＜0.05)；高劑量組與中劑量組小鼠的ACHE無顯著差異(p＞0.05)；高劑量組小鼠的ACP、GSH顯著高于中劑量組(p＜0.05)；中、低劑量組小鼠的GSH無顯著差異(p＞0.05)(圖3)。表明美洲大蠊粉能夠提高腹瀉小鼠結(jié)腸解毒酶(GSH、ACHE、ACP)對(duì)外來化合物的解毒代謝能力。

圖3 美洲大蠊粉對(duì)腹瀉小鼠結(jié)腸GSH、ACHE、ACP的影響Fig.3 Effects of P.americana powder to GSH,ACHE and ACPin colon of diarrhea mice

2.4 美洲大蠊粉對(duì)腹瀉小鼠結(jié)腸消化能力(LDH、AMS、LPS)的影響 建模成功后，分別以不同劑量的美洲大蠊粉治療腹瀉小鼠，試驗(yàn)結(jié)束后取其結(jié)腸組織和結(jié)腸內(nèi)容，采用試劑盒測(cè)定各組小鼠結(jié)腸LDH、AMS、LPS活性。結(jié)果顯示，在飼喂美洲大蠊粉10 d后，小鼠結(jié)腸中的LDH、AMS、LPS活性顯著升高(p＜0.05)，且高劑量組顯著高于低劑量組(p＜0.05)。模型組與空白組相比，小鼠的LDH、AMS、LPS活性顯著降低(p＜0.05)；與空白組相比，高劑量組的LDH、AMS、LPS和中、低劑量組小鼠的AMS均無顯著差異(p＞0.05)，中、低劑量組小鼠的LDH、LPS顯著降低(p＜0.05)；與模型組相比，高、中、低劑量組小鼠的LPS和高、中劑量組小鼠的LDH、AMS活性均顯著升高(p＜0.05)，低劑量組小鼠的LDH、AMS無顯著差異(p＞0.05)；高劑量組小鼠的LDH、AMS、LPS顯著高于低劑量組(p＜0.05)，且高劑量組小鼠的LDH、LPS顯著高于中劑量組(p＜0.05)；中劑量組小鼠LPS活性顯著高于低劑量組(p＜0.05)；中、低劑量組小鼠的LDH、AMS無顯著差異(p＞0.05)(圖4)。表明美洲大蠊粉能夠提高腹瀉小鼠結(jié)腸消化酶(LDH、AMS、LPS)在腹瀉小鼠體內(nèi)的食物消化能力。

圖4 美洲大蠊粉對(duì)腹瀉小鼠結(jié)腸LDH、AMS、LPS的影響Fig.4 Effects of P.americana powder to LDH,AMS and LPS in colon of diarrhea mice

2.5 美洲大蠊粉對(duì)腹瀉小鼠結(jié)腸總菌與大腸桿菌數(shù)量的影響 試驗(yàn)結(jié)束后，采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定結(jié)腸中大腸桿菌數(shù)和總菌數(shù)。結(jié)果顯示，在飼喂美洲大蠊粉10 d后，小鼠結(jié)腸中的大腸桿菌和總菌數(shù)顯著降低，且高劑量組顯著低于低劑量組(p＜0.05)。空白組與模型組相比，總菌數(shù)、大腸桿菌數(shù)顯著增加(p＜0.05)；與空白組相比，高劑量組小鼠的總菌數(shù)和大腸桿菌數(shù)差異不顯著(p＞0.05)；中、低劑量組小鼠的總菌數(shù)和大腸桿菌數(shù)顯著增加(p＜0.05)；與模型組相比，高、中、低劑量組小鼠的總菌數(shù)和大腸桿菌數(shù)均顯著減少(p＜0.05)；高劑量組小鼠的大腸桿菌數(shù)和總菌數(shù)顯著高于中、低劑量組(p＜0.05)；中、低劑量組小鼠的大腸桿菌數(shù)和總菌數(shù)差異不顯著(p＞0.05)(圖5)。表明美洲大蠊粉能夠降低腹瀉小鼠結(jié)腸中大腸桿菌和其它雜菌的感染能力。

圖5 美洲大蠊粉對(duì)腹瀉小鼠結(jié)腸總菌與大腸桿菌數(shù)量的影響Fig.5 Effects of P.americana powder to total bacterial and E.coliin colon of diarrhea mice

3 討論

由于生活環(huán)境的多樣性，美洲大蠊能夠攜帶多種致病病原物，如隱孢子蟲、大腸肝菌、沙門氏菌等，其中隱孢子蟲存在于美洲大蠊腸道內(nèi)[7]。鑒于隱孢子蟲、大腸肝菌、沙門氏菌可在55℃被殺死[8]，本實(shí)驗(yàn)將美洲大蠊粉置55℃烘干，保證了美洲大蠊粉在藥用期間安全有效。大腸桿菌是引起人類和動(dòng)物腹瀉的主要病原菌之一，常會(huì)造成腸道菌群失調(diào)，生理代謝異常[9]。為確保腹瀉模型小鼠死亡率在可控范圍，本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射大腸桿菌ATCC43255 0.02 mL/g(3×108cfu/mL)建立腹瀉模型。

當(dāng)病原物感染時(shí)，動(dòng)物機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的羥基、過氧基等自由基，與生物膜結(jié)合造成機(jī)體損傷，為了減少自由基給機(jī)體帶來的傷害，SOD、CAT、GSH等酶的活性被激發(fā)[10-11]。SOD含量高則清除超氧陰離子(O2-)的能力強(qiáng)，CAT含量增加能夠加速體內(nèi)過氧化物的分解。本實(shí)驗(yàn)中，腹瀉引起小鼠結(jié)腸組織中SOD、POD、CAT下降，飼喂美洲大蠊粉含量分別為8 %(高劑量組)、5 %(中劑量組)、2.5 %(低劑量組)的飼料后，高劑量治療組小鼠結(jié)腸的SOD、高劑量和中劑量治療組的POD、3種劑量治療組的CAT均顯著高于模型組，表明飼喂不同劑量的美洲大蠊粉能提高腹瀉小鼠結(jié)腸抗氧化能力，以高、中劑量治療組的效果最好。

ACP、GSH和ACHE活性的增加能夠有效降低動(dòng)物體內(nèi)有害物質(zhì)的危害。當(dāng)小鼠發(fā)生腹瀉，引起結(jié)腸組織中GSH、ACHE、ACP活性降低，造成有害物質(zhì)增加。飼喂含不同劑量的美洲大蠊粉飼料后，各劑量治療組小鼠的GSH、ACHE顯著高于模型組，高劑量和中劑量組小鼠的ACP顯著高于模型組，表明飼喂不同劑量的美洲大蠊粉能夠提高腹瀉小鼠清除結(jié)腸組織內(nèi)有害物質(zhì)，同樣以高、中劑量治療組的效果最好。

當(dāng)動(dòng)物發(fā)生腹瀉，參與機(jī)體消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代謝的LPS、LDH和AMS的活性也會(huì)發(fā)生變化。小鼠腹瀉會(huì)引起結(jié)腸組織中LDH、AMS、LPS活性降低，造成結(jié)腸組織消化、吸收等正常功能被破壞。飼喂含不同劑量的美洲大蠊粉飼料后，各劑量治療組的LPS顯著高于模型組，高劑量和中劑量治療組的AMS、LDH顯著高于模型組，表明美洲大蠊粉能夠改善腹瀉小鼠結(jié)腸機(jī)體功能，同樣以高、中劑量治療組的效果最好。

動(dòng)物腹瀉主要是引起了消化系統(tǒng)微生物紊亂，維持其動(dòng)態(tài)平衡具有重要意義。腹腔注射大腸桿菌后，導(dǎo)致小鼠腹瀉，其結(jié)腸內(nèi)總菌數(shù)和大腸桿菌數(shù)大量增加，破壞了腸道內(nèi)容物微生物的動(dòng)態(tài)平衡。飼喂含不同劑量的美洲大蠊粉飼料后，各劑量組的大腸桿菌數(shù)、總菌數(shù)顯著低于模型組，其中高劑量治療組小鼠的大腸桿菌數(shù)量低于空白組，表明美洲大蠊粉能夠有效抑制腹瀉小鼠結(jié)腸內(nèi)容物中總菌數(shù)和大腸桿菌數(shù)的增加，高劑量組的效果顯著高于中、低劑量組。

何小姣等研究顯示美洲大蠊提取液具有抗結(jié)腸炎的作用[12]；Zhang等研究顯示美洲大蠊提取液具有消炎及提高免疫的作用[13]；美洲大蠊粉也能夠抑制腹瀉小鼠結(jié)腸組織中有害物質(zhì)及總菌數(shù)和大腸桿菌數(shù)的增加，提高腹瀉小鼠抗病的能力，表明美洲大蠊全粉及其提取物均能夠達(dá)到治療炎癥及抗腹瀉的作用。由于美洲大蠊粉含有多種化學(xué)成分，如蛋白質(zhì)[14]、油酸[15]、微量元素、維生素[16]等，是否將其純化或者蟲粉應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。當(dāng)然，通過美洲大蠊粉添加于小鼠飼料中能夠增強(qiáng)腹瀉小鼠結(jié)腸酶活性和菌群平衡，可見其具有藥用功效，能夠在生產(chǎn)實(shí)踐中推廣應(yīng)用。