響應(yīng)面優(yōu)化提取草莓多酚及其抗氧化活性研究

李芬芳，馬艷弘，趙密珍，黃開紅，段云青

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，山西太谷 030801；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，江蘇南京 210014；4.句容萬山紅遍生物科技有限公司，江蘇鎮(zhèn)江 212402)

草莓(FragariaananassaDuck)為薔薇科植物草莓的果實，別稱有洋莓、地莓、蠶莓、蛇莓、雞冠果等[1]。草莓含有豐富的多酚、花青素、酚酸和黃酮類等生物活性物質(zhì)，不僅具有較強的抗氧化能力，同時還具有較高的清除自由基的能力[2-3]。此外，草莓中含有豐富的維生素C、維生素E、β胡蘿卜素、褪黑激素及酚類化合物等抗氧化物質(zhì)[4]，其中酚類化合物是最能影響草莓植物化學(xué)性質(zhì)的主要組成成分之一[5]。酚類物質(zhì)為草莓中最主要的抗氧化物質(zhì)，在抗氧化、抑菌、抗癌、抗腫瘤和抑制心腦血管疾病等方面具有顯著功效，被廣泛用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域[6]。近些年通過大量引進國外的優(yōu)質(zhì)草莓品種，我國的草莓種類和數(shù)量已經(jīng)位于世界前列。國內(nèi)對草莓的采后保鮮以及貯藏進行了很多研究，但是對草莓的生物活性及生理功能的研究還處于起步階段，與國際上的研究存在有很大的差距[7]，因而需進一步開發(fā)市場前景廣闊的草莓多酚活性產(chǎn)品[8-9]。

國內(nèi)外很多學(xué)者對植物多酚的提取方法做了大量的研究，采用的方法主要有溶劑萃取法、酶解提取法、微波輔助提取法和超聲波輔助提取法等[10-12]。其中溶劑萃取法因其操作簡便、成本低廉、便于后續(xù)分離純化等優(yōu)點成為目前國內(nèi)使用最廣泛的多酚提取方法。目前國內(nèi)對植物多酚的提取、純化和生物活性的研究主要集中在茶多酚、蘋果多酚、石榴多酚等少數(shù)幾種，而有關(guān)草莓多酚的提取及抗氧化活性的報道卻不多。本試驗擬對草莓多酚提取工藝條件進行優(yōu)化，并測定草莓多酚粗提物的體外抗氧化能力，旨在為草莓的深度開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草莓由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所提供；福林酚試劑，源葉生物技術(shù)有限公司；DPPH，上海源葉生物科技有限公司；羥自由基測定試劑盒、抗超氧陰離子自由基測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；無水乙醇、沒食子酸、碳酸鈉(均為分析純試劑)，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；HJ-6A多頭磁力攪拌器：常州國華儀器有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；D-B5型紫外可見分光光度計：上海奧析科學(xué)儀器有限公司；JJ-500電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠；TGL-16B臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；RE6000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；ZD-F12真空冷凍干燥機：南京載智自動化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 草莓多酚提取方法 將新鮮草莓洗凈、瀝干水分、破碎打漿，與一定濃度的乙醇溶液混合均勻，恒溫提取一定時間，4 500 r/min離心25 min，沉淀再重復(fù)提取2次，合并3次上清，得多酚提取液。將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，用HPD400大孔樹脂純化，50%乙醇溶液洗脫3次，合并洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，真空冷凍干燥至恒質(zhì)量得草莓多酚粉。

1.3.2 總酚的測定 采用福林酚比色法[13-14]測定，以沒食子酸為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別加入5 mL蒸餾水，1 mL 福林酚試劑和3 mL 7.5% Na2CO3溶液，45 ℃水浴加熱90 min后，在波長760 nm處測吸光度，得到?jīng)]食子酸質(zhì)量濃度與吸光度的回歸方程：y=0.011 27x+0.001 97(r2=0.999 8)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算草莓多酚含量，再按照如下公式計算多酚提取得率：多酚得率(按沒食子酸計)(mg/g)=(C×V/m)×100%，式中C為比色杯中多酚質(zhì)量濃度(mg/mL)，V為多酚提取液總體積(mL)；m為草莓總質(zhì)量(g)。

1.3.3 單因素試驗設(shè)計 分別以料液比、提取時間、提取溫度、乙醇體積分數(shù)4個因素作單因素試驗，考察各因素對多酚提取量的影響。

1.3.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝條件 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件進行響應(yīng)面設(shè)計，優(yōu)化草莓多酚的提取工藝。

1.3.5 抗氧化活性測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力測定[15-16]準(zhǔn)確稱取 12.5 mg DPPH標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇溶解并定容至250 mL。準(zhǔn)確量取不同體積的樣品溶液，加去氧水補足1 mL，分別加入5 mL DPPH·溶液，充分混合，靜止30 min，于517 nm處測吸光值DS，5 mL DPPH·溶液與1 mL無水乙醇混合后測吸光度D0，5 mL無水乙醇與1 mL樣品溶液混合后測吸光度Db。以同濃度維生素C為對照，在517 nm處測吸光度。每個樣品平行測定3次，DPPH·清除率公式如下：

清除率=[D0-(DS-Db)]/D0×100%。

1.3.5.2 抗超氧陰離子自由基能力測定 配制0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg/mL的樣品溶液，按照試劑盒說明書操作，取同濃度維生素C溶液作為對照，無水乙醇作空白對照，超氧陰離子自由基清除能力計算公式如下：

抗超氧陰離子活力單位(U/L)=(D550 nm(對照組)-D550 nm(試驗組))/(D550 nm(對照組)-D550 nm(標(biāo)準(zhǔn)組))×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL)×1 000 mL。

1.3.5.3 清除羥自由基能力的測定 分別取0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg/mL的樣品溶液，按照試劑盒說明書操作，其呈色與·OH的多少呈正比關(guān)系，即吸光度越小，樣品對羥自由基的清除能力越強。取同濃度維生素C溶液作為對照，無水乙醇作空白對照，羥自由基抑制能力計算公式：抑制率=(D對照組-D試驗組)/D對照組×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓多酚提取單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 料液比對草莓多酚得率的影響 在50 ℃分別以料液比1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40(g ∶mL)，70%乙醇濃度對草莓漿液浸提2 h，隨料液比增大，多酚提取率逐漸增大，在1 g ∶35 mL處多酚得率達到最大值，說明多酚的溶出量已經(jīng)達到飽和，故最終確定最佳提取料液比為1 g ∶35 mL(圖1)。

2.1.2 提取時間對草莓多酚得率的影響 在50 ℃以料液比 1 g ∶20 mL 、70%乙醇濃度對草莓漿液分別提取0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h。在提取時間2 h以內(nèi)，多酚提取率對著提取時間的延長而逐漸增大，超過2 h以后，提取率逐漸趨于平緩。表明充足的提取時間可以使溶劑充分接觸，從而提高得率，當(dāng)時間超過2 h以后，多酚溶出基本達到平衡狀態(tài)(圖2)。因此，確定最佳提取時間為2 h。

2.1.3 乙醇濃度對草莓多酚得率的影響 以料液比 1 g ∶20 mL，50 ℃對草莓漿液進行提取，乙醇濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%。如圖3所示，當(dāng)乙醇濃度小于50%時，隨著乙醇濃度的增加總多酚提取率逐漸提高，當(dāng)乙醇濃度達到50%時，總多酚的提取率達到最大，此后隨著乙醇濃度的增加其提取率逐漸減小(圖3)?？赡苁怯捎谶^高濃度的乙醇溶液會引起細胞蛋白質(zhì)的變性，影響多酚類物質(zhì)的溶出，導(dǎo)致提取率降低[17]，最終確定最佳提取乙醇濃度為50%。

2.1.4 溫度對草莓多酚得率的影響 以料液比1 g ∶20 mL，70%乙醇濃度對草莓漿液提取2 h，溫度分別為20、30、40、50、60、70 ℃，小于60 ℃范圍內(nèi)，隨著提取溫度的升高，提取率逐漸升增高，當(dāng)溫度大于60 ℃后，多酚得率呈下降趨勢(圖4)。表明溫度越高越有利于多酚的溶出，但是溫度太高，草莓中的酚類物質(zhì)有可能因溫度過高發(fā)生氧化等變化[18]，且溫度增高需要更多的熱能，從節(jié)能經(jīng)濟的角度出發(fā)，確定最佳提取溫度為60 ℃。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝條件

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果分析 根據(jù)Box-Behnken原理，綜合單因素試驗結(jié)果，以草莓多酚得率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化提取條件。選取料液比(A)、提取時間(B)、乙醇濃度(C)、提取溫度(D)為自變量，采用4因素3水平共29個試驗點的響應(yīng)面法分析試驗(表1、表2)。

表1 草莓多酚提取工藝響應(yīng)面分析試驗的因素與水平

表2 草莓多酚提取工藝響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果

應(yīng)用Design Expert 8.0.6.1軟件對試驗結(jié)果進行多元回歸分析，得到以草莓多酚提取率為響應(yīng)值的回歸方程為：Y=2.44+0.083A-0.13B-0.054C+0.097D-0.14AB-0.074AC-0.083AD+0.044BC+0.073BD+0.047CD-0.22A2-0.31B2-0.12C2-0.084D2。

表3 方差分析結(jié)果

注：“**”表示影響極顯著(P<0.01)，“*”表示影響顯著(P<0.05)，N表示影響不顯著(P>0.05)。

2.2.2 響應(yīng)面圖分析與優(yōu)化 響應(yīng)曲面圖中曲面的陡峭程度可以表明變量對提取率的影響程度，曲面較陡表明影響較大，反之則較小；等高線圖反映了因素間交互作用的強弱，橢圓形表示交互作用顯著，圓形則表示交互作用不顯著(圖5)。根據(jù)回歸方程，作響應(yīng)面圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，分析液料比、時間、乙醇濃度和溫度對提取量的影響。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[20]。料液比與時間交互作用的響應(yīng)面坡度陡，說明二者交互作用顯著；同一提取時間下，隨料液比增加，提取率增加；與之相比，在同一料液比的水平下，隨著提取時間的增加，提取率達到最佳后開始減小(圖5-a)。料液比與乙醇濃度交互作用的響應(yīng)面坡度較陡，等高線較密集，說明二者交互作用顯著；同一乙醇濃度下，隨料液比增加，提取率增加；與之相比，在同一料液比的水平下，隨著乙醇濃度的增加，提取率增加幅度較緩慢(圖5-b)。料液比與溫度交互作用的響應(yīng)面坡度較陡，等高線密集，說明二者交互作用較顯著；在同一溫度下，隨料液比增加，提取率增加；與之相比，在同一料液比的水平下，隨著溫度的增加，提取率增加幅度緩慢(圖5-c)。對圖5進行分析可得出，溫度、時間和料液比對多酚提取量影響極為顯著，乙醇濃度對多酚提取量影響最小。

2.2.3 響應(yīng)面最優(yōu)提取工藝條件及驗證試驗 通過軟件分析得到草莓多酚醇提最佳提取工藝為：料液比1 g ∶40 mL、時間 1.74 h、乙醇濃度43.07%、浸提溫度56.62 ℃，在此條件下，草莓多酚醇提得率為2.417 29 mg/g。為了操作方便，修正最佳提取工藝條件為：料液比1 g ∶40 mL、時間104 min、乙醇濃度43%、浸提溫度57 ℃。在此條件下，進行3次平行試驗，所得提取率平均值為2.392 mg/g，實測值與預(yù)測值相對誤差為0.73%，說明該優(yōu)化設(shè)計方案可以較好地預(yù)測草莓多酚醇提情況。

2.3 抗氧化活性測定

2.3.1 對DPPH自由基的清除能力 隨著溶液濃度的增加，草莓多酚DPPH·自由基能力逐漸增強，在相同質(zhì)量濃度下，草莓多酚清除DPPH·的能力低于維生素C。當(dāng)草莓多酚溶液濃度達0.16 mg/mL時，其清除率為93.33%(圖6)。

2.3.2 對超氧陰離子的清除能力 隨著溶液濃度的增加，2種樣品抗超氧陰離子自由基能力不斷增強；相同濃度條件下，維生素C抗自由基能力高于草莓多酚樣品。當(dāng)草莓多酚溶液濃度達0.16 mg/mL濃度時，其抗自由基能力達 165.16 U/L(圖7)。

2.3.3 對羥自由基的清除能力 隨著2種樣品溶液濃度的增加，羥自由基抑制率不斷增加。同濃度時維生素C對羥自由基的抑制能力大于草莓多酚樣品。當(dāng)草莓多酚濃度達 0.16 mg/mL 時，羥自由基抑制率達78.68%(圖8)。

3 結(jié)語

通過單因素試驗和Box-Behnken響應(yīng)曲面法優(yōu)化，確定草莓多酚提取的最佳試驗條件為料液比1 g ∶40 mL、提取時間104 min、乙醇濃度43%、提取溫度57 ℃。各因素對多酚得率的影響從大到小依次為提取時間>提取溫度>料液比>乙醇濃度。此最佳工藝條件下草莓多酚的提取率(按沒食子酸計)為2.392 mg/g。用所提取的草莓多酚粗提物對DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基的清除能力進行體外抗氧化評價試驗，可以發(fā)現(xiàn)其具有較強的自由基清除力，在一定的濃度范圍內(nèi)，提取液質(zhì)量濃度與氧化活性呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系。隨著草莓多酚濃度呈線性增加，當(dāng)多酚濃度為0.16 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率達到93.33%，抗超氧陰離子能力達165.16 U/L，對羥自由基抑制率達78.68%。

隨著近幾年對植物多酚研究的不斷深入，多酚類物質(zhì)的抗氧化作用開始被廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域，因此草莓中酚類物質(zhì)作為一種功能性食品添加劑具有廣闊的開發(fā)前景。因此，本方法所優(yōu)化提取的草莓多酚實際上是一種良好的天然抗氧化劑的前體物質(zhì)，極具深入研究和開發(fā)的價值。

[1]Kalt W，F(xiàn)orney C F，Martin A，et al.Antioxidant capacity，vitamin C，phenolics，and anthocyanins after fresh storage of small fruits[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47(11)：4638-4644.

[2]Tulipani S，Mezzetti B，Antioxidants C F，et al.And nutritional quality of different strawberry genotypes[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56(3)：696-704.

[3]Cai Y，Luo Q，Sun M，et al.Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer[J].Life Sciences，2004，74(17)：2157-2184.

[4]Buendía B，Gil M I，Tudela J A，et al.HPLC-MS analysis of proanthocyanidin oligomers and other phenolics in 15 strawberry cultivars[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58(7)：3916-3926.

[5]Seeram，P N，Lee，et al.Identification of phenolic compounds in strawberries by liquid chromatography electrospray ionization mass spectroscopy[J].Food Chemistry，2006，97(1)：1-11.

[6]吳建華，吳志瑰，裴建國，等.多酚類化合物的研究進展[J].中國現(xiàn)代中藥，2015，17(6)：630-636.

[7]張欣馨，王 菲，李 浪，等.中國草莓生產(chǎn)中面臨的主要問題及發(fā)展對策[J].中國林副特產(chǎn)，2016(2)：92-96.

[8]Kumaran A，Karunakaran R J.Activity-guided isolation and identification of free radical-scavenging components from an aqueous extract ofColeusaromaticus[J].Food Chemistry，2007，100(1)：356-361.

[9]于漫漫，弓志青，曹 暉，等.不同品種草莓抗氧化能力的分析[J].中國食物與營養(yǎng)，2016，22(2)：63-66.

[10]唐福才，姚敦琛，關(guān)天旺，等.龍眼核中多酚提取及抗氧化活性的研究[J].食品研究與開發(fā)，2015，36(12)：5-9.

[11]伍 鶴，王遠亮，趙 琳，等.藍莓多酚提取方法及功能活性研究進展[J].食品與機械，2015(2)：257-261.

[12]許惠玲，蔡為榮，曹天亮，等.荷葉多酚提取優(yōu)化及其在黃酒中的應(yīng)用[J].食品工業(yè)科技，2015，36(8)：277-281.

[13]Amin I，Norazaidah Y，Hainida K I.Antioxidant activity and phenolic content of raw and blanchedAmaranthusspecies[J].Food Chemistry，2006，94(1)：47-52.

[14]Mahdavi R，Nikniaz Z，Maryam R，et al.Determination and comparison of total polyphenol and vitamin C contents of natural fresh and commercial fruit juices[J].Pakistan Journal of Nutrition，2010，9(10)：968-972.

[15]王和才，胡秋輝.DPPH法測定紫紅薯提取物清除自由基的能力[J].食品研究與開發(fā)，2010，31(1)：132-135.

[16]Aruoma O I.Nutrition and health aspects of free radicals and antioxidants[J].Food and Chemical Toxicology，1994，32(7)：671-683.

[17]顏棟美，李仁菊，丘 華，等.金花茶多酚提取工藝的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2007，23(9)：45-49.

[18]歐陽玉祝，李 勇，吳道宏，等.路邊青多酚的穩(wěn)定性及其熱降解動力學(xué)[J].食品科學(xué)，2011，32(15)：46-48.

[19]王欽德，楊 堅.食品試驗設(shè)計與統(tǒng)計分析[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2002.

[20]王允祥，呂鳳霞，陸兆新.杯傘發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)曲面法優(yōu)化研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，27(3)：89-94.