煙草NtSYP121基因克隆、表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)分析

熊 雪，殷雙琴，陳 欣，王麗紅，宋文強(qiáng)，李立芹

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 作物科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，四川 成都 611130)

植物本身無(wú)法主動(dòng)逃避不利環(huán)境，為適應(yīng)各種外來(lái)以及內(nèi)在脅迫，植物細(xì)胞不斷調(diào)整并最終形成了特有的內(nèi)膜系統(tǒng)和膜泡運(yùn)輸機(jī)制以完成細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的物質(zhì)交流[1]。植物 SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein attachment protein receptor)類蛋白是一類具有抗生物和非生物逆境功能的蛋白。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多植物SNARE蛋白可通過(guò)調(diào)節(jié)離子通道、控制蛋白質(zhì)密度、直接與受體作用等方式來(lái)調(diào)節(jié)離子運(yùn)輸，從而對(duì)刺激性反應(yīng)作出應(yīng)答[2]。SNAREs蛋白是可溶性NSF附著蛋白受體，是介導(dǎo)鈣離子依賴的囊泡膜與突觸膜融合的核心分子復(fù)合體[3]。SNARE蛋白的分類方法有兩種：根據(jù)膜融合過(guò)程中SNARE蛋白所處位置，可分為v-SNAREs和t-SNAREs[4]；而根據(jù)SNAREs模體(motif)氨基酸的不同，又可將SNAREs分兩類：Q(谷氨酰胺)和R(精氨酸)，Q-SNARE包括Syntaxin和SNAP25兩個(gè)亞家族；R-SNARE包括synaptobrivin/vamp亞家族。擬南芥基因組編碼24個(gè)syntaxin型Q-SNARE，3個(gè)SNAP25型Q-SNARE，14個(gè)VAMP型R-SNARE。Syntaxin型Q-SNARE又可細(xì)分為8個(gè)亞家族(Syp1-Syp8)[2]。

SYP121是亞家族蛋白Syntaxin中的一員。在擬南芥中，SYP121調(diào)控K+通道的亞基KC1，并與AKT1形成三元復(fù)合物SYP121-KCl-AKT1共同參與植物的鉀營(yíng)養(yǎng)[5]。Grefen[6]發(fā)現(xiàn)SYP121和KC1互作是與一個(gè)FxRF模體相關(guān)聯(lián)的，而這個(gè)FxRF模體獨(dú)特地位于SNARE序列的前12個(gè)殘基。Geelen等[7]發(fā)現(xiàn)，SYP121介導(dǎo)了高爾基復(fù)合體和質(zhì)膜之間的囊泡運(yùn)輸。也有研究表明，SYP121的功能失活能改變KATI鉀通道的定位[8]。此外，AtSYP121還可以提高植物的抗病性。例如，Kwon等[9]研究發(fā)現(xiàn)，AtSYP121能與SNAP33和VAMP721/VAMP722形成復(fù)合體，共同調(diào)控病原體侵染時(shí)的細(xì)胞分泌。Maekawa等[10]發(fā)現(xiàn)SYP121參與擬南芥抵抗白粉病生理過(guò)程。Kiyono等[11]的研究結(jié)果表明過(guò)量表達(dá)SYP121和重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體MerC融合蛋白能增加擬南芥中鎘積累和耐受性。在煙草中，Leyman等[12]研究發(fā)現(xiàn)SYP121在保衛(wèi)細(xì)胞中調(diào)控K+和Cl-通道，推測(cè)在脫落酸信號(hào)中起作用。

綜上所述，Syntaxin家族蛋白對(duì)植物的抗逆性起重要作用，但是在煙草中的相關(guān)研究卻比較少。因此，本研究利用K326煙草克隆了NtSYP121基因?qū)Σ?duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)，運(yùn)用Real-time PCR分析了其在根、莖、葉、花及低鉀、高鹽、干旱和ABA處理下基因的表達(dá)水平，并成功構(gòu)建NtSYP121-pBI121過(guò)表達(dá)載體，這對(duì)于NtSYP121響應(yīng)逆境脅迫的功能研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

實(shí)驗(yàn)所用材料是K326煙草，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生理與生物技術(shù)系提供。首先進(jìn)行漂浮育苗，待其生長(zhǎng)到十字期，將其移栽到花盆中，每盆種植一株。對(duì)煙株正常生長(zhǎng)的根、莖、葉和花進(jìn)行取樣，然后在液氮中速凍，放置-80 ℃冰箱，以供后續(xù)試驗(yàn)使用。

將煙草品種K326種子表面消毒后布種于MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)15 d后挑取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗分別進(jìn)行ABA、PEG、高鹽和低鉀處理，每個(gè)處理設(shè)有3個(gè)重復(fù)。其中，ABA、PEG及高鹽處理培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別加入ABA(1 μmol·L-1)、PEG6000(5%)、NaCl(200 mmol·L-1)處理；低鉀處理時(shí)將待處理材料轉(zhuǎn)移到低鉀培養(yǎng)基上，低鉀培養(yǎng)基是將MS培養(yǎng)基中的KNO3去掉，并且將KH2PO4替換為NH4H2PO4，其余成分相同，經(jīng)測(cè)定鉀離子濃度為10 μmol·L-1。所有處理在0、3、6、12、24 h后進(jìn)行整株取樣。

通用型DNA純化回收試劑盒購(gòu)自天根公司；DH5α大腸埃希菌菌株購(gòu)于Vazyme Biotech公司；Trizol試劑、cDNA合成試劑盒、載體PMD19-T、高保真Pfu酶、PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Green Master mix、限制性內(nèi)切酶、DNA Ligation Kit 2.0等試劑購(gòu)自TaKaRa生物公司，引物合成與測(cè)序由成都梓熙擎科公司完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 克隆目的基因

取幼嫩的煙草葉片于液氮中速凍1 min后用Trizol試劑法提取其總RNA，再根據(jù)cDNA合成試劑盒的操作要求，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系為10 μL，在EP管中依次加入0.5 μL OligodT，5 μL RNA，0.5 μL無(wú)菌水，輕微搖勻后，在PCR儀上65 ℃變性5 min，再在冰上急冷2 min；然后再依次加入2 μL 5×Reaction Buffer，0.5 μL RNase Inhbitor，1 μL 10 mmol·L-1dNTP，0.5 μL Reverse Transcripase，在PCR儀上42 ℃反應(yīng)60 min，72 ℃延伸10 min后終止反應(yīng)，取出1 μL稀釋10倍備用，其余-20 ℃保存。

參考NCBI GenBank收錄的普通煙草NtSYP121序列(登錄號(hào)：NM_001325000)，采用同源克隆的方法用DNAMAN設(shè)計(jì)引物NtSYP121-F和NtSYP121-R(表1)，再以其稀釋過(guò)的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為10 μL，分別加入5 μL 2×Perime STAR Mixture，0.2 μL 引物F (10 μmol·L-1)，0.2 μL 引物R (10 μmol·L-1)，1 μL cDNA，3.6 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸2.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min，1個(gè)循環(huán)；4 ℃永久保存。

1.2.2 PCR產(chǎn)物的回收、克隆與測(cè)序

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將目的條帶按照TIANGEN Universal DNA Purification Kit的說(shuō)明操作進(jìn)行純化回收，將目的片段與pMD19-T載體16 ℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)，隨后在涂有含氨芐青霉素(Ampicillin)的LB平板上進(jìn)行篩選，采用菌落PCR法檢測(cè)陽(yáng)性克隆，然后送到成都梓熙擎科公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 目的基因的生物信息學(xué)分析

使用ExPASyProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)NtSYP121基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析；利用 DNAMAN 軟件分析其編碼蛋白的疏水性，進(jìn)行蛋白序列比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；運(yùn)用(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/struc-ture/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行保守功能域分析；采用PSORT (http://psort.hgc.jp/form.html)預(yù)測(cè)NtSYP121的亞細(xì)胞定位；采用IBCP(http://npsa-pbil.ibcp.fr)的在線工具SOPMA預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)；使用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org)在線預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.4NtSYP121-pBI121過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

采用全長(zhǎng)含有酶切位點(diǎn)引物NtSYP121-pBI121-F和NtSYP121-pBI121-R擴(kuò)增目的基因(表1)，擴(kuò)增結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物和pBI121載體分別進(jìn)行雙酶切，酶切體系10 μL：10×T Buffer 0.5 μL，BSA 1 μL，BamHⅠ 1 μL；SmaⅠ 1 μL；PCR產(chǎn)物/pBI121載體 4 μL； ddH2O 2.5 μL。酶切后回收目的片段和pBI121載體，于16 ℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)，隨后在含有卡那霉素的LB平板上進(jìn)行篩選，菌落PCR檢測(cè)篩選陽(yáng)性克隆后，搖菌提取質(zhì)粒，雙酶切后送至成都梓熙擎科公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 基因的表達(dá)模式分析

根據(jù)目的基因的序列，使用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)其熒光定量PCR的引物NtSYP121qF和NtSYP121qR(表1)。提取煙草總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為25 μL，依次加入：SYBRⅡ 12.5 μL，引物F、R各1 μL，cDNA 1.5 μL，ddH2O 9 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)。所有樣品都設(shè)置3個(gè)重復(fù)來(lái)擴(kuò)增目的基因，以煙草18S基因設(shè)計(jì)引物作為實(shí)驗(yàn)的內(nèi)標(biāo)定量，擴(kuò)增目的基因。擴(kuò)增結(jié)束后，按2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 各基因的引物序列

注:GGATCC為BamHⅠ；CCCGGG為SmaⅠ。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的克隆

以煙草葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示在1 000 bp左右的位置上有清晰的條帶(圖1)。采用切膠回收的方法對(duì)該條帶進(jìn)行純化后，與pMD19-T載體16 ℃連接過(guò)夜，隨后對(duì)獲得陽(yáng)性克隆隨機(jī)挑選3個(gè)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示：目的片段大小為903 bp。

M為Marker 2 000 bp；1為NtSYP121圖1 NtSYP121的克隆

2.2 編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及疏水性

使用ExPASyProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)NtSYP121基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)的分子量為34 ku，理論等電點(diǎn)pI為7.76；帶正電荷的氨基酸殘基(精氨酸+賴氨酸)總數(shù)是43，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(天冬氨酸和谷氨酸)總數(shù)是42，該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)是40.07，由此說(shuō)明該蛋白可能是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白。該蛋白脂肪系數(shù)為85.13，總的平均疏水性為-0.551，用DNAMAN軟件進(jìn)行的疏水性分析結(jié)果顯示(圖2)，預(yù)測(cè)該蛋白屬于親水性蛋白。

2.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)

使用IBCP(http://npsa-pbil.ibcp.fr)的在線工具SOPMA，對(duì)NtSYP121的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果(圖3中A)表明：α-螺旋約占65.00%，無(wú)規(guī)則卷曲約占20.00%，延伸鏈占8.33%，β-轉(zhuǎn)角占6.67%，由此可見(jiàn)，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的最大元件為α-螺旋。使用SWISS-MODEL對(duì)NtSYP121的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖3中B所示，并將結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)比照，結(jié)果較為統(tǒng)一，所得三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果較為可信。利用 Swiss-PdbViewer分析同源建模結(jié)果，表明其立體三維結(jié)果比較穩(wěn)定，所以其同源建模的結(jié)果是相對(duì)可靠的。

A，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；B，三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖3 NtSYP121的二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4 NtSYP121的同源性

為了探明NtSYP121與其他植物基因的同源性，把NtSYP121編碼的氨基酸序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行了BLAST比對(duì)，然后在DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果(圖4中A)顯示，NtSYP121與各植物中的SYP121蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列是高度保守的。將NtSYP121氨基酸序列與其他同源性比較近的植物SYP121序列進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明，NtSYP121與漸窄葉煙草SYP121-like、絨毛狀煙草SYP121-like、番茄SYP121-like等具有較高的氨基酸序列同源性，分別為99%、98%、94%(圖4中B)。

2.5 編碼蛋白的功能保守域及亞細(xì)胞定位

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的CDD軟件對(duì)目的基因所編碼蛋白的功能保守域進(jìn)行了分析，結(jié)果(圖5)表明，該蛋白具有SNARE-Syntaxin家族典型的N端結(jié)構(gòu)，且屬于t-SNARE蛋白，說(shuō)明其是多功能蛋白家族SNARE的亞家族蛋白Syntaxin的一員。使用PSORT(http://psort.hgc.jp/form.html)在線預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位，根據(jù)預(yù)測(cè)的結(jié)果得知，在質(zhì)膜上的可能性為0.440，在線粒體內(nèi)膜上的可能性為0.100，在高爾基體上的可能性為0.100，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的可能性為0.850。根據(jù)以上結(jié)果預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。

2.6 構(gòu)建NtSYP121-pBI121過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pBI121載體分別進(jìn)行雙酶切，回收后連接并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌，培養(yǎng)陽(yáng)性菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取，然后進(jìn)行雙酶切，電泳結(jié)果(表6)顯示，能夠酶切出目的基因的條帶，表明NtSYP121-pBI121過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.7 NtSYP121的組織表達(dá)分析

以普通煙草K326的根、莖、葉、花cDNA為

A：NtSYP121蛋白多重序列比對(duì)；B：NtSYP121蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)圖4 NtSYP121同源性分析

M，Marker 5 000 bp；1，NtSYP121圖6 NtSYP121-pBI121過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

模板進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，分析NtSYP121在各個(gè)部位的表達(dá)量，結(jié)果(圖7)表明，NtSYP121的表達(dá)量由高到低依次為根>花>葉>莖，其在根中的表達(dá)量是分別是花、葉、莖中表達(dá)量的15.0、20.2、26.4倍，這說(shuō)明NtSYP121基因主要在煙草植株的根中表達(dá)，并且其表達(dá)存在組織特異性。

圖7 NtSYP121在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量分析

2.8 NtSYP121在ABA和PEG處理下的表達(dá)

將煙草K326幼苗移苗至含有1 μmol·L-1ABA和5% PEG6000MS培養(yǎng)基上處理3、6、12、24 h，然后進(jìn)行取樣提取RNA。采用Real-time PCR對(duì)NtSYP121在逆境脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ABA處理后，NtSYP121在3 h的表達(dá)量上調(diào)，隨后在6 h的表達(dá)量下降且低于對(duì)照(0 h)，在6 h和24 h表達(dá)量又逐漸上調(diào)，其中在24 h時(shí)NtSYP121的表達(dá)量上調(diào)到最大值，為對(duì)照(0 h)的1.72倍；在PEG處理后，NtSYP121在3 h表達(dá)量明顯增加，其中在24 h時(shí)該基因表達(dá)量達(dá)到最大值，為對(duì)照(0 h)的4.70倍。因此NtSYP121參與ABA和PEG脅迫生理過(guò)程(圖8)。

圖8 ABA和PEG處理下NtSYP121的表達(dá)模式分析

2.9 NtSYP121在高鹽和低鉀處理下的表達(dá)

把生長(zhǎng)15 d的煙草幼苗轉(zhuǎn)移到高鹽和低鉀培養(yǎng)基上處理3、6、12和24 h，然后進(jìn)行取樣提取RNA。采用Real-time PCR對(duì)NtSYP121在逆境脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高鹽處理后，NtSYP121在3 h的表達(dá)量下降，僅為對(duì)照(0 h)的11%；隨后表達(dá)量上調(diào)，6 h時(shí)表達(dá)量上調(diào)為對(duì)照的74%；12 h及以后表達(dá)量又繼續(xù)下降。在低鉀處理3、6、12 h后，NtSYP121表達(dá)量都是下降的，12 h時(shí)最低，為對(duì)照(0 h)的2%；隨后24 h時(shí)表達(dá)量上調(diào)為對(duì)照的77%。上述結(jié)果表明高鹽和低鉀處理下NtSYP121表達(dá)量明顯降低(圖9)。

圖9 高鹽和低鉀處理下NtSYP121的表達(dá)模式分析

3 討論

本研究從普通煙草K326中克隆到一個(gè)Syntaxin家族成員NtSYP121的cDNA序列，其ORF為903 bp，編碼300個(gè)氨基酸。編碼蛋白的功能保守域分析，該基因編碼的蛋白具有SNARE-Syntaxin家族典型的結(jié)構(gòu)。利用軟件分析該蛋白的亞細(xì)胞定位，表明該蛋白質(zhì)定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。而在Collins等[13]和Leyman等[14]對(duì)擬南芥和煙草的研究中，SYP121基因編碼的蛋白定位在質(zhì)膜上；李文琦[15]對(duì)木薯MeSYP121蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)其定位到高爾基體中。今后將通過(guò)定位實(shí)驗(yàn)(如綠色熒光蛋白標(biāo)記)來(lái)研究NtSYP121蛋白的定位，這對(duì)于其功能的研究具有重要的意義。組織表達(dá)分析結(jié)果表明，NtSYP121基因的表達(dá)具有組織特異性，在煙草K326的根中表達(dá)量最高，而在莖、葉、花中表達(dá)量很低，其中在莖中的表達(dá)量最低。Leyman等[14]在煙草Nicotiana的研究中也發(fā)現(xiàn)該基因所編碼的蛋白在根中表達(dá)量最高，而莖、葉、花中表達(dá)量較低，本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，因此推測(cè)NtSYP121主要在煙草根中發(fā)揮功能。

植物經(jīng)歷干旱脅迫時(shí)，ABA被普遍認(rèn)為是一種干旱信號(hào)而傳遞干旱信息。逆境脅迫下，ABA通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)相關(guān)基因和蛋白表達(dá)，從而提高植物對(duì)多種逆境脅迫的抗性[16-17]。已有研究表明，ABA能提高植物對(duì)干旱脅迫的抗性[18-20]。在ABA(1 μmol·L-1)處理后，NtSYP121基因表達(dá)量表現(xiàn)為在3 h上升，在6 h時(shí)下降且低于對(duì)照，隨后該基因表達(dá)量又逐漸上升且高于對(duì)照，最后在24 h時(shí)表達(dá)量最高；Real-time PCR分析結(jié)果表明：PEG處理后，NtSYP121的表達(dá)受到顯著誘導(dǎo)，其中在12 h時(shí)該基因表達(dá)量最高；這與Leyman等[12]研究結(jié)果類似。在NaCl(200 mmol·L-1)和低鉀脅迫處理后，Real-time PCR結(jié)果表明NtSYP121基因的表達(dá)量與對(duì)照相比，呈下降趨勢(shì)，而在Leyman等[14]在煙草Nicotiana的研究中，使用Northern blot方法檢測(cè)該基因的表達(dá)量在NaCl(300 mmol·L-1)處理1 h升高，使用Western blot方法測(cè)得該蛋白的表達(dá)量在6 h明顯升高，而后逐漸降低，在24 h時(shí)表達(dá)量與對(duì)照沒(méi)有區(qū)別。導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不同的原因可能是植物的生長(zhǎng)時(shí)期，鹽處理濃度和檢測(cè)方法的不同。要明確NtSYP121參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。已成功構(gòu)建NtCBL1基因的過(guò)量表達(dá)載體，后續(xù)工作可通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究該基因的功能。

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