高光平 朱利霞 張東林 趙希艷 閆艷娟 高桂生 史秋梅 郭順立（河北科技師范學(xué)院/河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室 河北 秦皇島 066604）

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狐貍源大腸桿菌毒力島基因HPI、LEE的檢測

高光平 朱利霞 張東林 趙希艷 閆艷娟 高桂生 史秋梅 郭順立（河北科技師范學(xué)院/河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室 河北 秦皇島 066604）

為檢測從狐貍體內(nèi)分離的大腸桿菌的毒力島基因和毒力，對從病死狐貍的肝臟、肺臟等器官分離的細(xì)菌進行了生化鑒定、毒力試驗和毒力島HPI(irp2、fyuA)與LEE(ler、eaeA)檢測。結(jié)果表明：在所測的6株菌中有4株檢測出HPI毒力島基因，6株菌均未檢測出LEE毒力島基因，各注射菌液組小鼠均不同程度發(fā)病，且含有HPI毒力島基因的菌株對小鼠的毒力較強，可見分離到的菌株對狐貍的健康養(yǎng)殖存在較大的危害。

狐貍 大腸桿菌 分離鑒定 毒力島基因

大腸桿菌(Escherichia coil，E.coli)是一種極為常見的引起人畜共患傳染病的桿菌，也是人和動物體內(nèi)最常見菌之一，在宿主免疫力低下或者發(fā)生二次感染時可能會導(dǎo)致大腸桿菌病的發(fā)生[1]，會造成幼齡狐貍腹瀉甚至死亡，成年狐貍飼料利用率降低進而影響其毛皮質(zhì)量，給養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟損失。毒力島(Pathogenicity island, PAI)是細(xì)菌染色體上分子量較大(通常>30Kb)、G+Cmol% 及密碼使用與宿主菌染色體有明顯差異的毒力基因簇[3，4]。在豬、人、牛、兔的腹瀉病中分離到的大腸桿菌中均已發(fā)現(xiàn)了致病性LEE毒力島和HPI毒力島的存在，并與其致病性有很大的關(guān)系[5]。在多種腸道桿菌中均可發(fā)現(xiàn)HPI毒力島，如大腸桿菌、沙門菌、克雷伯菌等，HPI在不同種屬中分布可能是通過基因的水平轉(zhuǎn)移[6]。

本研究擬通過細(xì)菌的分離鑒定、毒力試驗、PCR基因擴增進行狐貍源大腸桿菌毒力島基因HPI、LEE的檢測和毒力分析，為更好地預(yù)防和控制狐貍大腸桿菌病發(fā)揮有益的探索作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株從河北省及周邊地區(qū)病死狐貍肝臟、肺臟等分離，由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室保存。

1.1.2 試驗動物 昆明系小白鼠42只，20±2g，雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物有限公司。

1.1.3 材料 普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)，ID32E腸道菌鑒定試劑條(法國梅里埃)，樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)，DL2000 Marker、2×Taq Marker Mix、Gold View核酸染色(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)。

1.1.4 儀器 FGEN02TD型PCR擴增儀(北京東勝創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司)，ATB全自動生化鑒定系統(tǒng)(法國梅里埃)，DYY-12型電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，BIO-BEST200E凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)菌分離鑒定 對病死狐貍進行剖檢，無菌取肝臟、肺臟等器官分別在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基劃線接種，37℃培養(yǎng)24h后純化培養(yǎng)，染色鏡檢。挑取單菌落置于LB培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)過夜，編號分別為C1-1，C2-2，C3-1，C4-1，C4-28，C5-6，4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)菌生化特性鑒定 用ATB全自動生化鑒定系統(tǒng)進行生化試驗。

1.2.3 細(xì)菌DNA的提取 按樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒說明書提取大腸桿菌基因組DNA，﹣20℃冰箱中備用。

1.2.4 HPI、LEE相關(guān)基因引物設(shè)計 根據(jù) Gen Bank 中的序列，設(shè)計出HPI(irp2和fyuA)和LEE(ler和eaeA)基因這4對特異性引物，由上海生工生物工程有限公司合成。Irp2：P1：5'-AAGGATTCGCTGTTACCGGA-3'，P2：5'-GGCATATTGACGATTAACGAA-3'，退火溫度58℃，擴增基因片段大小為301bp。FyuA：P1：5’-ACACGGCTTTA TCCTCTGGC-3’，P2：5'-GGCATATTGACGATTAACGA A-3'，退火溫度58℃，擴增基因片段大小為953bp。Ler：P1：5'-CGCACACAAGCCCATAC-3'，P2：5'-GATGAGT TCCGGCGAGCAA-3'，退火溫度58℃，擴增基因片段大小為196bp。eaeA：P1：5'-TAACGGCTATTTCCGCATGA -3'，P2：5'-TCCCAGACGATACGATCCAG-3'，退火溫度58℃，擴增基因片段大小為552bp。

1.2.5 多重PCR方法鑒定HPI和LEE的毒力島相關(guān)基因 1.2.3提取的的DNA作為模板，進行多重PCR方法鑒定HPI和LEE的毒力島相關(guān)基因。PCR擴增反應(yīng)體系(20μl)：先取2×DNAMarker10μl，然后加入PCR水7μl，再加入DNA模板1μl，最后分別在對應(yīng)的試液中加入上、下引物各1μl，94℃條件下預(yù)變性10min，94℃條件下變性40s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共30個循環(huán)；72℃下延伸10min[7]。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，電流90~100mA，電壓100~110V，電泳時間60min，放入凝膠成像系統(tǒng)中觀察和捕獲圖象。

1.2.6 毒力試驗 42只小鼠隨機分為7組，每組6只，設(shè)第1、2、3、4、5、6組為試驗組，第7組為對照組，試驗組每只小鼠腹腔注射0.2ml菌液(濃度為1×109cfu/ml)。對照組6只小鼠腹腔注射0.2ml生理鹽水。觀察各組小鼠致死情況，并取死亡小鼠的肝臟、肺臟等器官進行分離鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

通過分離菌在各種培養(yǎng)基上的形態(tài)、染色鏡檢和ATB全自動生化鑒定系統(tǒng)的結(jié)果綜合分析，分離菌為E.coli。

2.2 毒力島PCR檢測結(jié)果

1~4分別為C1-1菌株ler、eaeA、irp2、fyuA檢測結(jié)果；5~8分別為C2-2菌株ler、eaeA、irp2、fyuA檢測結(jié)果；9~12為C3-1菌株ler、eaeA、irp2、fyuA檢測結(jié)果；13為maker；14~17為C4-1菌株ler、eaeA、irp2、fyuA檢測結(jié)果；18~21為C4-28菌株ler、eaeA、irp2、fyuA檢測結(jié)果；22~25為C5-6菌株ler 、eaeA、irp2、fyuA檢測結(jié)果。

附圖 HPI和LEE毒力島PCR檢測結(jié)果

注：marker最上面的條帶大小為2000bp，向下依次為1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。

由附圖可見，3，4，16，17，20，21，24，25檢出HPI毒力島基因，即在6株狐貍源的大腸桿菌分離株中，檢測出含有irp2和fyuA基因的大腸桿菌有4株(C1-1、C4-1、C4-28和C5-6)；6株狐貍源大腸桿菌里均未檢測出LEE毒力島基因。

2.3 毒力試驗結(jié)果

注射C1-1、C4-1、C4-28、C5-6菌株攻毒的試驗組小鼠大約72h之內(nèi)相繼全部死亡，主要癥狀表現(xiàn)為呼吸急促、運動遲緩、食欲下降；注射C2-2和C3-1菌株攻毒的試驗組小鼠24h左右發(fā)病，主要癥狀表現(xiàn)為腹瀉，無出現(xiàn)死亡癥狀；對照組6只小鼠觀察7d后仍健康存活。對被注射C1-1、C4-1、C4-2、C5-6菌株攻毒的試驗組死亡小鼠進行剖檢，取肝臟、肺臟進行細(xì)菌分離培養(yǎng)、鑒定，所獲菌與從死亡的狐貍體內(nèi)分離的菌一致，結(jié)果表明攜帶HPI毒力島基因的分離株對小鼠具有很強的毒力。

3 討論

使用PCR方法檢測HPI和LEE毒力島基因，在6株分離菌株中有4株(66.7%)檢測出了HPI毒力島基因irp2和fyuA。根據(jù)報道，E.coli攜帶致病性毒力島，能引起水貂的大腸桿菌病，且呈急性死亡[8]，進一步表明了毒力島與細(xì)菌的毒力有很密切的聯(lián)系，但其結(jié)果也會受到許多其他因素的影響。本次試驗結(jié)果與報道的大腸桿菌含有的致病性HPI毒力島結(jié)果的基本一致[9]。根據(jù)相關(guān)報道在其他多種動物的致病性大腸桿菌中均已發(fā)現(xiàn)存在有HPI毒力島[10]，在本試驗中檢測的6株菌中有4株攜帶有HPI毒力島基因，且與其毒力有密切的聯(lián)系，所以它的研究意義不容小覷，非常值得對其進行進一步的研究。雖然本次試驗未在大腸桿菌中檢測出LEE毒力基因，但在其它報道中LEE在大腸桿菌中是存在的，這可能與此次研究大腸桿菌的分離菌株較少和來源地有關(guān)。

4 結(jié)論

通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化鑒定等方法鑒定出分離的菌株為大腸桿菌。6株狐貍源大腸桿菌分離菌株中有4株攜帶有耶爾森菌HPI毒力島基因irp2和fyuA，均未檢測出LEE毒力島基因ler和eaeA。攜帶有耶爾森菌HPI毒力島基因的狐貍源大腸桿菌對小鼠的毒力較強。

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（2017–09–25）

S852.61+2

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