利用豬口腔液對(duì)豬場(chǎng)豬繁殖與呼吸綜合征抗體進(jìn)行檢測(cè)

劉穎昳，劉金蘭，單瑛琦，王紅梅，吳佳俊，翟新驗(yàn)*

（1．中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100260；2．北京市房山區(qū)原種豬場(chǎng)，北京 102400；3．北京市大興區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督管理局，北京 100260；4．北京六馬養(yǎng)豬科技有限公司，北京 101300）

豬咀嚼物品時(shí)，可通過齒齦和位于口腔黏膜和齒齦組織的毛細(xì)血管滲出豬口腔液，其成分與血清相似，可反應(yīng)出血清中的激素、藥物、抗體和病毒等各種組分[1-3]。目前已有商品化的工具用于豬只口腔液的收集。該采樣方法無創(chuàng)傷、應(yīng)激小、非常適合用于豬群病原及抗體水平的監(jiān)測(cè)[4-5]。

利用豬口腔液進(jìn)行病原和抗體監(jiān)測(cè)，目前已經(jīng)有多項(xiàng)報(bào)道[1-3]。已報(bào)道的豬口腔液可用于監(jiān)測(cè)的疫病包括豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）[6-9]、圓環(huán)II型病毒病[10]、甲型流感[11]、非洲豬瘟[12]和口蹄疫[13-14]。口腔液檢測(cè)可成功檢出病原陽性，與拭子檢測(cè)結(jié)果符合率較高。而且，口腔液檢測(cè)還可成功檢出抗體變化趨勢(shì)，與血清結(jié)果具有較好的符合率。其中，PRRS的檢測(cè)技術(shù)最成熟，已經(jīng)有商用PRRS抗體檢測(cè)ELISA試劑盒，可得到穩(wěn)定檢測(cè)結(jié)果。美國(guó)愛德華州立大學(xué)的Jeffrey Zimmerman教授報(bào)道了多項(xiàng)關(guān)于豬唾液采樣及其在病原及抗體檢測(cè)中的應(yīng)用[6-8]。上述研究表明口腔液采樣作為一種有潛力的監(jiān)測(cè)方法，有希望廣泛應(yīng)用于豬場(chǎng)和養(yǎng)殖戶。但是目前的大多數(shù)研究是基于背景清晰的SPF豬的實(shí)驗(yàn)型研究，對(duì)于情況更為復(fù)雜的養(yǎng)殖場(chǎng)，其應(yīng)用仍需要進(jìn)一步數(shù)據(jù)支持。

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)該方法在豬場(chǎng)的實(shí)際使用效果，我們利用PRRS弱毒活疫苗分別免疫母豬和仔豬，然后分不同時(shí)間段進(jìn)行口腔液和血清采集，然后使用商品化的試劑盒分別測(cè)定血液和口腔液中PRRS抗體的消長(zhǎng)水平，比較血液和唾液中的抗體消長(zhǎng)規(guī)律并分析結(jié)果，進(jìn)一步完善利用豬口腔液用于PRRS抗體水平評(píng)價(jià)的方法，以便使該技術(shù)在種豬場(chǎng)進(jìn)行技術(shù)推廣和使用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取3頭母豬（胎次：5～6胎，大白和長(zhǎng)白，一年免疫兩次PRRS活疫苗）用于個(gè)體血液和口腔液樣品的采集；同時(shí)選取母豬對(duì)應(yīng)的3圈仔豬（20 日齡，每圈8～10 頭，未免疫）用于群體血液和口腔液樣品的采集。選取的PRRS活疫苗為高致病性豬繁殖與呼吸道綜合征活疫苗TJMF92株（購(gòu)自新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司）。

母豬和仔豬同日免疫PRRS活疫苗，免疫后7 d（1周）、14 d（2周）、21 d（3周）、28天(4周 )、35 d（5周）、42 d（6周）、49 d（7周）后分別采集口腔液；并同時(shí)通過耳緣靜脈采血。3頭母豬分別采集血液和口腔液；3圈小豬隨機(jī)取3頭采血，每圈共采集1份口腔液。

1.2 口腔液采集

自制未經(jīng)漂白的原色棉繩。母豬用的棉繩直徑為1．5 cm；仔豬用棉繩直徑為0．8 cm。根據(jù)實(shí)驗(yàn)豬舍圍欄高度，將棉繩剪成約80 cm長(zhǎng)，使用前，將棉繩在121 ℃下高壓滅菌20 min并烘干。使用前將棉繩末端打散供豬咀嚼，繩子盡量遠(yuǎn)離污物。調(diào)節(jié)高度，保證豬容易咀嚼到。吸引豬群咀嚼15～30 min后，取下棉繩，將濕潤(rùn)的末端放入大密封袋（8號(hào)）用力擠壓?？芍貜?fù)采集，待口腔液收集量達(dá)3～5 mL，將其轉(zhuǎn)入離心管中，離心吸取上清。

1.3 試劑盒基本信息

依據(jù)說明書，使用IDEXX PRRS口腔黏液抗體檢測(cè)試劑盒和IDEXX PRRS X3抗體檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)口腔液和血清中的PRRS抗體（采購(gòu)自北京協(xié)信詩(shī)華生物科技有限公司）。結(jié)果計(jì)算公式：S/P值=（樣品的OD值—陰性對(duì)照值）/（陽性對(duì)照值-陰性對(duì)照值）；S/P值＞0．40，判為陽性；S/P值≤ 0．40，判為陰性 。

依據(jù)說明書，使用西班牙HIPRA PRRS血液、口腔液二合一抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)口腔液和血清中的豬繁殖與呼吸綜合征抗體（采購(gòu)自北京天之泰生物科技有限公司）。結(jié)果計(jì)算公式：IRPC=（樣品的OD值—陰性對(duì)照值）/（陽性對(duì)照值-陰性對(duì)照值）×100。IRPC＞20．0，判為陽性；IRPC≤20．0，判為陰性。

圖1 自制口腔液采樣套裝

圖2 母豬監(jiān)測(cè)結(jié)果

圖3 仔豬監(jiān)測(cè)結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 口腔液采集效果

對(duì)于母豬和仔豬口腔液采樣，在早晨（或者下午，需固定采樣時(shí)間）喂食前采集樣品成功率較高，對(duì)于單頭母豬，如果首次采樣，母豬不咬繩子的話，將棉繩手動(dòng)塞入母豬口中直至其咀嚼，訓(xùn)練1～2次后，后續(xù)可順利學(xué)會(huì)咀嚼棉繩，母豬樣品量約為3～5 mL。對(duì)于仔豬，如果首次采樣，仔豬不咬繩子的話，將繩子用5%蔗糖水浸泡潤(rùn)濕，訓(xùn)練1～2次后，后續(xù)仔豬可順利學(xué)會(huì)咀嚼棉繩，仔豬樣品量約為5～8 mL。離心后上清呈輕微渾濁淺黃色溶液。

2.2 血清與口腔液抗體檢測(cè)結(jié)果

母豬血清與口腔液抗體檢測(cè)結(jié)果：利用IDEXX檢測(cè)試劑盒檢查母豬血清與唾液中的PRRS抗體存在一定相關(guān)性。在免疫后1～5周內(nèi)， PRRS抗體水平基本保持一致，但在第5周抗體水平顯著升高（圖2A，圖2C）。而利用HIPRA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)母豬血清與唾液中的PRRS抗體，其中血清中抗體水平一直處在較高的水平（圖2B），但唾液中的PRRS抗體水平在第5周顯著升高（圖2D）。為了進(jìn)一步表明母豬口腔液抗體水平和血清中抗體水平的關(guān)系，我們對(duì)免疫后不同時(shí)間的血清和口腔液中PRRS抗體陽性結(jié)果符合率進(jìn)行了匯總整理，見表1。

仔豬血清與口腔液抗體檢測(cè)結(jié)果：利用IDEXX檢測(cè)試劑盒檢查仔豬血清與唾液中的PRRS抗體存在一定相關(guān)性。在免疫后1～5周內(nèi)，PRRS抗體水平基本保持一致，但在第5周抗體水平顯著升高（圖3A，圖3C）。同時(shí)利用HIPRA檢測(cè)試劑盒檢查仔豬血清與唾液中的PRRS抗體也存在一定相關(guān)性。在免疫后1～5周內(nèi)，PRRS抗體水平基本保持一致，但在第5周抗體水平顯著升高（圖3B，圖3D）。

2.3 血清與口腔液抗體檢測(cè)結(jié)果陽性符合率

根據(jù)上述結(jié)果計(jì)算血清和口腔液中PRRS抗體陽性率的符合率，符合率=口腔液中PRRS抗體陽性率/血清中PRRS抗體陽性率100%（表1）。對(duì)于母豬，免疫后5周后經(jīng)兩種試劑盒檢出符合率為100%；對(duì)于仔豬，免疫后4周經(jīng)IDEXX試劑盒檢出符合率為100%，免疫后6周經(jīng)HIPRA試劑盒檢出符合率為100%。

3 討論

豬口腔液中抗體初期主要是IgA和IgM，后期主要為IgG，水平較高且持續(xù)時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)數(shù)周。已經(jīng)證實(shí)豬口腔液中抗體與血清中抗體水平存在相關(guān)性[3，6，15]?；谶@種相關(guān)性，已經(jīng)開發(fā)出商用口腔液PRRS抗體檢測(cè)ELISA試劑盒。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)該方法的實(shí)際使用效果，我們?cè)u(píng)估了不同試劑盒對(duì)母豬和仔豬口腔液中的PRRS抗體的檢測(cè)結(jié)果，并與血清結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果表明在口腔液中，總抗體水平較低。母豬和仔豬中，均是在免疫后第5周在口腔液中檢出抗體水平峰值。此外，之前有研究證實(shí)口腔液中PRRS抗體在免疫后5周達(dá)到峰值，10周后即迅速降低，而相應(yīng)的血清抗體則可持續(xù)14周仍保持較高水平[8，15，16]，我們的結(jié)果與上述研究結(jié)果相似。但是在本研究中，由于未持續(xù)跟蹤豬群的抗體水平，對(duì)血清和唾液中抗體水平消長(zhǎng)規(guī)律無法進(jìn)行完整描述，例如7周后血清和唾液中免疫抗體變化等，因此無法給出抗體持續(xù)時(shí)間。

表1 免疫后不同時(shí)間2種試劑盒檢測(cè)血清和口腔液中PRRS抗體陽性結(jié)果符合率 %

2個(gè)不同品牌試劑盒對(duì)血清和口腔液PRRS抗體的檢測(cè)結(jié)果存在一定差異。我們發(fā)現(xiàn)IDEXX試劑盒在進(jìn)行口腔中不同時(shí)間段PRRS抗體檢測(cè)時(shí)，其口腔抗體與血清抗體陽性符合率對(duì)于母豬和仔豬分別是免疫后5周和4周達(dá)到100%；HIPRA試劑盒對(duì)于母豬和仔豬分別是免疫后5周和6周達(dá)到100%（表1）。HIPRA試劑盒為口腔液血清二合一試劑盒，可同時(shí)檢測(cè)口腔液和血清樣品，因此，豬場(chǎng)可根據(jù)實(shí)際需求進(jìn)行選擇。由于口腔液抗體水平較低，根據(jù)我們的結(jié)果，對(duì)于所有豬群免疫后6周，使用兩種品牌的試劑盒均可得到較好結(jié)果。

此外，我們觀察到，HIPRA試劑盒檢測(cè)母豬血清中PRRS抗體時(shí)，從免疫后第1周開始，抗體水平始終處于較高水平，并未檢出上升趨勢(shì)（圖2，圖3），可能是由于母豬持續(xù)免疫PRRS弱毒疫苗，血清中IgG抗體水平較高，HIPRA二合一試劑盒用于血清檢測(cè)時(shí)，針對(duì)的是血清中的IgG抗體，因此母豬免疫初期抗體即在較高水平。因此，建議在免疫抗體水平較高的母豬中，使用口腔液進(jìn)行PRRS抗體檢測(cè)，有助于排除本底干擾，可檢測(cè)到因免疫新近產(chǎn)生的抗體。

4 小結(jié)

PRRS免疫抗體可通過口腔液進(jìn)行檢測(cè)。免疫后6～7周采集口腔液樣本進(jìn)行檢測(cè)，可進(jìn)行免疫效果監(jiān)測(cè)，結(jié)果與血清結(jié)果符合率較高。同時(shí)，不同試劑盒檢測(cè)效果有差異，應(yīng)根據(jù)采樣時(shí)間和采樣豬群選擇合適試劑盒。

致謝:北京市生豬產(chǎn)業(yè)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（基金號(hào)：BAIC02-2017）

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